2,436
个编辑
更改
RIA
,无编辑摘要
图16-1 RIA原理示意图
图16-2 剂量反应曲线 === （一）标记物===
标记用的核素有放射γ射线和β射线两大类。前者主要为131I、125I、57[[Cr]]和60[[Co]]；后者有14C、3H和32P。放射性核素的选择首先考虑比活性。例如125I比活性的理论值是64.38×104GBq/g（1.74×104Ci/g），有较长[[半衰期]]的14C最大比活性是166.5GBq/g（4.5Ci/g）。两者相比，1mol125I或14C结合到抗原上，125I的[[敏感]]度约比14C大3900倍。又因为125I有合适的半衰期，低[[能量]]的γ射线易于标记，因而125I是目前常用的放射免疫分析标记物。
标记125I的方法可分两大类，即直接标记法和间接标记法。
放射性碘标记率的高低与抗原（蛋白质或多肽）[[分子]]中酪氨酸的含量及分子中酪氨酸的暴露程度有关，当分子中含有较多的酪氨酸，又暴露在外时，则标记率就高。
标记方法：将纯化抗原和125I加入小试管底部，[[然后]]将新鲜配制的氯胺T快速冲入，混匀振荡数十秒～2min后加入偏重[[亚硫酸]]钠终止反应。再加入[[KI]]溶液稀释。然后在[[葡聚糖]]G柱上[[分离]]，逐管收集。分别用井型闪烁计数器测定放射性强度（[[脉冲]]数/min,cpm），前部为标记抗原峰，后部为游离125I峰。在标记抗原峰试管内加等量1％[[白蛋白]]作[[稳定剂]]，此即为标记抗原液。 === （三）标记物的鉴定===
1．放射性游离碘的含量用三氯[[醋酸]]（预先在受[[鉴定]][[样品]]中加入[[牛血]]清白蛋白）将所有蛋白质沉淀，分别测定沉淀物和上[[清液]]的cpm值。一般要求游离碘在总放射性碘的5％以下。标记抗原在贮存过久后，会出现标记物的脱碘，如游离碘超过5％则应重新纯化去除这部分游离碘。
如：5μgh[[GH]]用2mCiNa125I进行标记，标记率为40％，则
含有特异性抗体的[[抗血清]]是RIA的主要试剂，常以抗原免疫小动物诱发产生[[多克隆抗体]]而得。抗血清的质量直接影响分析的灵敏度和特异性。抗血清质量的指标主要有亲和[[常数]]、交叉反应率和滴度。
== RIA的测定方法==
用RIA进行测定时分三个步骤，即抗原抗体的竞争抑制反应、B和F的分离及放射性的[[测量]]。 === （一）抗原抗体反应===
将抗原（[[标准品]]和受检标本）、标记抗原和抗血清按顺序定量加入小试管中，在一定的温度下进行反应一定时间，使竞争抑制反应达到[[平衡]]。不同质量的抗体和不同含量的抗原对温育的温度和时间有不同的要求。如受检标本抗原含量较高，抗血清的亲和常数较大，可选择较高的温度（15～37℃）进行较短时间的温育，反之应在低温（4℃）作较长时间的温育，形成的抗原抗体复合物较为牢固。
在放射免疫分析反应中，标记抗原和特异性抗体的含量极微，形成的标记抗原抗体复合物（B）不能自行沉淀，因此需用一种合适的沉淀剂使它彻底沉淀，以完成与游离标记抗原（F）的分离。另外对[[小分]]子量的抗原也可采取[[吸附]]法使B与F分离。
4．[[活性炭]]吸附法小分[[子游]]离抗原或[[半抗原]]被活性炭吸附，[[大分]]子复合物留在溶液中。如在活性炭表面涂上一层葡聚糖，使它表面具有一定孔径的网眼，效果更好。在抗原与特异性抗体反应后，加入葡聚糖－活性炭。放置5～10min，使游离抗原吸附在活性炭颗粒上，离心使颗粒沉淀，上清液中含有结合的标记抗原。此法适用于测定类[[固醇]]激素，强心糖苷和各种[[药物]]，因为它们是相对非极性的，又比抗原抗体复合物小，易被活性炭吸附。
B、F分离后，即可进行放射性强度测定。测量仪器有两类，液体闪烁计数仪（β射线，如3H、32P、14C等）和[[晶体]]闪烁计数仪（β射线，如125、131I、57Cr等）。
RIA由于敏感度高、特异性强、[[精密度]]高、并可测定小分子量和大分子量物质，所以在医学检验中应用极为广泛，常用于测定各种激素（如[[甲状腺激素]]、[[性激素]]、[[胰岛素]]等）、微量蛋白质、[[肿瘤标志物]]（如AFP、CEA、CA-125、CA-199等）和药物（如[[苯巴比妥]]、[[氯丙嗪]]、[[庆大霉素]]等）等。各种检测项目均有试剂盒供应，而且仪器设备并不昂贵，所以在国内被广泛采用。但由于核素的放射性对[[人体]]有一定的[[危害]]性，必须加以防护，核素实验室的建设须经防疫部门的监督，操作人员须经过特殊训练。另外由于核素有半衰期，试剂盒的货存期较短，因而RIA在应用中有诸多不便之处。特别是近年来其他标记免疫分析技术如酶免疫分析、发光免疫分析等在技术上有飞跃的进展，高级仪器的自动化程度已可与[[生化]]自动分析仪相媲美，因此从长远前景看，RIA有被取代的趋势。但在目前，从所需的设备和检测的费用上，RIA还有一定的优越性，还将在一定时期内被医学检验实验室所采用。