化妆品中补骨脂特征成分补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮和补骨脂二氢黄酮的检测方法
《化妆品中补骨脂特征成分补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮和补骨脂二氢黄酮的检测方法》由国家食品药品监督管理局于2012年1月18日国食药监保化[2012]13号发布。
化妆品中补骨脂特征成分补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮和补骨脂二氢黄酮的检测方法
1 适用范围
本方法规定了用高效液相色谱法定性检测化妆品中补骨脂特征成分补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮和补骨脂二氢黄酮的方法。
本方法适用于化妆品中补骨脂特征成分补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮和补骨脂二氢黄酮的定性测定。
2 方法提要
样品在经过提取后，经高效液相色谱仪分离，二极管阵列检测器检测，经与平行操作的补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮和补骨脂二氢黄酮对照品及补骨脂对照药材比较，以保留时间和紫外光谱图定性，鉴别补骨脂特征成分补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮和补骨脂二氢黄酮的存在。本方法对补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮和补骨脂二氢黄酮的检出限和取样品0.5 g时的检出浓度见表1。
表1 4种补骨脂特征成分的检出限和检出浓度
|
检出限（ng） |
检出浓度（μg/g） |
|
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补骨脂素 |
0.3 |
0.6 |
|
异补骨脂素 |
0.3 |
0.6 |
|
新补骨脂异黄酮 |
0.3 |
0.6 |
|
补骨脂二氢黄酮 |
0.3 |
0.6 |
3 试剂和材料
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为实验室用一级水。
3.1 乙腈，色谱纯。
3.2 补骨脂素，纯度≥99%。
3.3 异补骨脂素，纯度≥99%。
3.4 新补骨脂异黄酮，纯度≥98%。
3.5 补骨脂二氢黄酮，纯度≥99%。
3.6 补骨脂，中国食品药品检定研究院，供鉴别用。
3.7 补骨脂特征性成分混合标准溶液（ =0.1 μg/mL）：分别称取补骨脂素（3.2）、异补骨脂素（3.3）、新补骨脂异黄酮（3.4）、补骨脂二氢黄酮（3.5）对照品各5 mg（精确到0.1 mg），置500 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度各为10 μg/mL的标准溶液。精密量取各标准溶液0.1 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得0.1 μg/mL的混合标准溶液。
3.8 补骨脂标准储备溶液：取补骨脂对照药材0.2 g，置50 mL三角瓶中，加30 mL 70%乙醇回流提取1h，滤过，滤液置100 mL量瓶中，加70%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。
4 仪器
4.1 高效液相色谱仪：具二极管阵列检测器。
4.2 分析天平：感量为0.1 mg。
4.3 移液器。
4.4 涡旋振荡器。
4.6 高速离心机：转速不小于10000 r/min。
5 测定步骤
5.1 样品预处理
膏、霜、乳类：称取0.5 g（精确至0.1 mg）样品，置10 mL量瓶中，加6 mL甲醇，涡旋振荡使试样与提取溶剂充分混匀，超声提取20 min，放至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，转移至10 mL具塞塑料离心管中，以12000 r/min离心5 min，上清液经0.45 μm滤膜过滤，滤液作为待测溶液备用。
液体类：称取0.5 g（精确至0.1 mg）样品，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，混匀，必要时，转移至10 mL具塞塑料离心管中，以12000 r/min离心5 min，上清液经0.45 μm滤膜过滤，滤液作为待测溶液备用。
固体粉类：称取0.5 g（精确至0.1 mg）样品，置10 mL量瓶中，加8 mL甲醇，混匀，超声提取20 min，放至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，静置，必要时，转移至10 mL具塞塑料离心管中，以12000 r/min离心5 min，上清液经0.45 μm滤膜过滤，滤液作为待测溶液备用。
5.2 高效液相色谱参考条件
色谱柱：C18柱（100 mm×4.6 mm，3 μm，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂）或具有同等柱效的色谱柱；
流动相：乙腈＋0.1%醋酸水溶液，梯度洗脱，洗脱程序见表1。
表1 流动相乙腈和酸水梯度洗脱程序（体积比）
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时间/min |
0 |
2 |
12 |
13 |
15 |
16 |
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乙腈＋0.1%醋酸水溶液 |
40＋60 |
40＋60 |
70＋30 |
90＋10 |
90＋10 |
40＋60 |
注：梯度洗脱条件，操作者可根据样品的不同选择最佳条件，使4种成分与其他组分峰获得完全分离。
流速：1.0 mL/min。
检测波长：246 nm。
柱温：30℃。
进样量：10 μL。
5.3 样品测定
按设定的色谱条件（5.2），取补骨脂特征性成分混合标准溶液（3.7）进样，进行高效液相色谱分析，记录各色谱峰相应的保留时间和紫外光谱图；取补骨脂标准储备溶液（3.8）进行高效液相色谱分析，记录各色谱峰相应的保留时间和紫外光谱图。取待测溶液（5.1）进样10 μL分析，若样品色谱图中，在与补骨脂特征性成分--补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮和补骨脂二氢黄酮对照品相应保留时间处有相同色谱峰出现，且具有相同的紫外光谱，则可以定性鉴别补骨脂特征性成分补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮和补骨脂二氢黄酮的存在。
5.4 平行试验
按以上步骤操作，对同一样品独立进行测定，获得的两次独立测试的色谱峰保留时间不得超过±1 min。
5.5 阳性结果确证
测定过程中若补骨脂素和异补骨脂素检出阳性结果，而新补骨脂异黄酮和补骨脂二氢黄酮低于检出限，可适当富集样品对新补骨脂异黄酮和补骨脂二氢黄酮的检测进一步确证。
6 精密度、稳定性和重复性
高、低两个浓度水平的补骨脂标准储备溶液的精密度、稳定性和重复性，在不同空白基质中，补骨脂素和异补骨脂素、新补骨脂异黄酮和补骨脂二氢黄酮4种特征性成分的保留时间和峰面积的RSD均小于5%（n=6）。
7 色谱图
图1 4种补骨脂特征成分混合标准溶液（10 μg/ mL）HPLC色谱图
图2 补骨脂标准溶液（2 mg/mL）HPLC色谱图
色谱峰：1. 补骨脂素，2. 异补骨脂素，3. 新补骨脂异黄酮，4. 补骨脂二氢黄酮
