==PCR步骤==
http://v.youku.com/v_show/id_XNTI0NjU5Njg=.html<b/videoflash>标准的PCR过程分为三步<==参看==*[[DNA]]*[[基因]]*[[DNA聚合酶]]*[[医学遗传学/b>：聚合酶链反应|《医学遗传学基础》- 聚合酶链反应]]
1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA 2.退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。 3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。 每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。如图所示： 现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq[[酶活性]]不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。 ==PCR反应特点==（1）特异性强 PCR反应的特异性决定因素为： ①引物与模板DNA特异正确的结合； ②[[碱基配对]]原则； ③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； ④靶基因的特异性与保守性。 其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶[[基因区]]，其特异性程度就更高。 （2）灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(μg=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个[[靶细胞]]；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。 （3）简便、快速 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用[[同位素]]，无[[放射性分类:生物]]污染、易推广。 （4）对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。 ==PCR的循环参数==1、预变性（Initial denaturation）：模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考[[试剂分类:生物学]]说明书，一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。 2、循环中的变性步骤：循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可 缩短该步骤时间。变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。 3、引物退火（Primer annealing）：退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。 4、引物延伸：引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略。延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其[[衍生物分类:医学视频]]的衍生设定为1min/kbp。 5、循环数：大多数PCR含25-40循环，过多易产生非特异扩增。 6、最后延伸：在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。
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