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== 方法类型和操作步骤==
酶联免疫吸附剂测定可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶[[作用]]的底物。根据试剂的来源和标本的[[性状]]以及[[检测]]的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。 === （一）双抗体夹心法===
双抗体夹心法（图15-4）是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：
根据同样原理，将[[大分]]子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。
在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原[[分子]]上两个不同[[抗原决定簇]]的[[单克隆抗体]]分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了[[反应时间]]，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的酶联免疫吸附剂测定提高到新水平。
图15-5双位点一步法示意图
在一步法测定中，应[[注意]]钩状[[效应]]（hookeffect），类同于[[沉淀反应]]中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。 === （三）间接法测抗体===
间[[接法]]（图15-6）是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的[[抗抗体]]以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：
本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。
图15-6间接法测抗体示意图 === （四）竞争法===
竞争法（图15-7）可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下：
图15-7竞争法测抗原示意图
血清[[中针]]对某些抗原的特异性[[IgM]]常和特异性IgG同时存在，后者会[[干扰]]IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法（图15-8），先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下：
（4）加[[入针]]对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。
（5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。 === （六）应用亲和素和生物素的酶联免疫吸附剂测定===
亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个[[生物素]]分子亲密结合。现在使用更多的是从[[链霉菌]]中提取的链霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又称[[维生素]]H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的[[衍生物]]，生物素－[[羟基]][[琥珀]]亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与[[蛋白质]]、[[糖类]]和酶等多种类型的[[大小]]分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为[[稳定]]。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似[[晶格]]的复合体。因此把亲和素和生物素与ELIS偶联起来，就可大提高酶联免疫吸附剂测定的敏感度。
== 酶联免疫吸附剂测定的技术要点==
酶联免疫吸附剂测定的技术要点包括三个方面：试剂的制备、反应条件的选择和操作的[[标准化]]。 === 试剂的制备=== 酶联免疫吸附剂测定的主要试剂为固相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体和与标记酶直接关联的酶反应底物。以下叙述这些试剂的原料和制备方法。 ==== （一）固相载体====
可作酶联免疫吸附剂测定中载体的物质很多，最常用的是聚[[苯乙烯]]。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的[[性能]]，抗体或蛋白质抗原吸附其上后保留原来的免疫活性。聚苯乙烯为[[塑料]]，可制成各种形式。在酶联免疫吸附剂测定测定过程中，它作为载体和容器，不参与化学反应。加之它的价格低廉，所以被普遍采用。
除塑料制品外，固相酶免疫测定的载体还有两种材料：一是微孔滤膜，如[[硝酸]][[纤维素]]膜、[[尼龙]]膜等，这类测定形式将在本章第五节“膜载体的酶免疫测定”[[中介]]绍。另一种载体是以含铁的磁性微粒制作的，[[反应时]]固相微粒悬浮在溶液中，具有液[[相反]]应的速率，反应结束后用磁铁吸引作为[[分离]]的手段，洗涤也十分方便，但需配备特殊的仪器。
在酶联免疫吸附剂测定实施过程中，抗原和抗体的质量是实验是否成功的关键因素。本法要求所用抗原纯度高，抗体[[效价]]高、亲和力强。
酶联免疫吸附剂测定所用抗原有三个来源：天然抗原、[[重组]]抗原和合成[[多肽]]抗原。天然抗原取材于动物[[组织]]或[[体液]]、[[微生物]]培养物等，一般含有多种抗原成分，需经纯化，提取出特定的抗原成分后才可应用，因此也称提纯抗原（purifiedantigen）。重组抗原（recombinantantigen）和多肽抗原（peptideantigen）均为人工合成品，使用安全，而且纯度高，[[干扰物]]质少。因此虽然制备合成抗原有较高的技术难度且要求较为昂贵的仪器设备和试剂，其应用仍十分普遍，特别是对那些天然抗原不易得到的试验，更显出其独到之处。
用于酶联免疫吸附剂测定的抗体有多[[克隆]]的和单克隆的。[[抗血清]]成分复杂，应从中提取IgG才可用于包被固相或酶标记。含单克隆抗体的小鼠[[腹水]]中的特异性抗体含量较高，有时可适当稀释后直接进行包被。制备酶结合物用的抗体的质量往往要求有较高的纯度。经[[硫酸]]铵[[盐析]]纯化的IgG可进一步用各种分子筛[[层析]]提纯。也可用亲和层析法提纯特异性IgG，如用酶[[消化]]IgG后提取的Fab片段，则效果更好。 ==== （三）免疫吸附剂====
固相的抗原或抗体称为免疫吸附剂。将抗原或抗体固相化的过程称为包被（coating）。由于载体的不同，包被的方法也不同。如以聚苯乙烯酶联免疫吸附剂测定板为载体，通常将抗原或抗体溶于[[缓冲液]]（最常用的为pH9.6的碳酸缓冲液）中，加于酶联免疫吸附剂测定板孔中在4℃过夜，经[[清洗]]后即可应用。如果包被液中的蛋白质浓度过低，固相载体表面有能被此蛋白质完全覆盖，其后加入的血清标本和酶结合物中的蛋白质也会部分地吸附于固相载体表面，最后产生非特异性显色而导致本底偏高。在这种情况下，如在包被后再用1％～5％[[牛血]]清[[白蛋白]]包被一次，可以消除这种干扰。这一过程称为封闭（blocking）。包被好的酶联免疫吸附剂测定板在低温可放置一段时间而不失去其免疫活性。
酶联免疫吸附剂测定中所用的酶要求纯度高、催化反应的[[转化率]]高、专一性强、性质稳定、来源丰富、价格不贵、制备成的酶标抗体或[[抗原性]]质稳定，继续保留着它的活性部分和催化[[能力]]。最好在受检标本中不存在与标记酶相同的酶。另外它的相应底物应易于制备和[[保存]]，价格低廉，有色产物易于测定，光[[吸收]]高。酶联免疫吸附剂测定中最常用的酶为[[辣根]]过氧化酶（HRP）和从[[牛肠]]粘膜或[[大肠杆菌]]提取的[[碱性磷酸酶]]（[[AP]]）。
除HRP和AP以外，在商品酶联免疫吸附剂测定试剂中应用的酶尚有[[葡萄糖氧化酶]]、[[β-半乳糖苷酶]]和脲酶等。β-[[半乳糖]]苷酸的底物常用4-甲基伞基-β-D半乳糖苷（4-mehtyumbelliferyl-β-D-galactoside），经酶水解后产生[[荧光]]物质4-甲基伞酮（4-mehtylumbelliferone），可用荧光计检测。荧光的放大作用大大提高了方法的敏感度。AP也可应用可产生荧光的伞基磷酸酯作底物。其缺点是[[需要]]荧光计测定，而且如用固相载体直接作为测定容器，此载体不可发出荧光。脲酶的特点是酶作用后反应液[[发生]]pH改变，可使[[指示剂]]变色；另外，在[[人体]]内没有内源酶（酶的化学发光底物见第十八章）。
酶标记的抗原或抗体称为结合物（conjugate）。抗原由于化学[[结构]]不同，可用不同的方法与酶结合。如为蛋白质抗原，基本上可参考[[抗体酶]]标记的方法。制备抗体酶结合物的方法通常有以下几种。
按以上方法制备的结合物一般混有未结合的酶和抗体。理论上结合物中混有游离酶不影响酶联免疫吸附剂测定中最后的[[酶活性]]测定，因经过洗涤，非特异性吸附于固相上的游离酶已被洗去。但游离的抗体则会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，因而减低结合到固相上的酶标抗体量。因此制备的结合物应予以纯化。纯化的方法较多，分离大分子[[混合物]]的方法均可应用。硫酸铵[[盐析法]]操作简便，但效果不如用SephadexG-200[[凝胶]][[过滤]]的好。
1．酶标抗抗体工作浓度的选择
表15-1 间接[[酶联免疫吸附剂测定法]]包被抗原工作浓度的选择
<table><tr><td>各类血清</td>
</tr><tr><td>1:50</td><td>1:100</td><td>1:200</td><td>1:400</td><td>1:800</td><td> </td></tr><tr><td>强阳性</td><td>1.20</td><td>1.04</td><td>0.84</td><td>0.68</td><td>0.42</td></tr><tr><td>弱阳性</td><td>0.64</td><td>0.41</td><td>0.30</td><td>0.22</td><td>0.19</td></tr><tr><td>阴性</td><td>0.23</td><td>0.13</td><td>0.08</td><td>0.66</td><td>0.05</td></tr><tr><td>稀释液</td><td>0.09</td><td>0.02</td><td>0.02</td><td>0.02</td><td>0.04</td></tr>
在夹心法酶联免疫吸附剂测定法中可用棋盘滴定法同时选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度，举例如下（表15-2）：
表15-2 夹心酶联免疫吸附剂测定包被抗体和酶标抗体工作浓度的选择
<table><tr>
</tr><tr><td>强阳性（25ng/ml）</td><td>弱阳性（1.5ng/ml）</td><td>阴性</td></tr><tr><td>10μg/ml</td><td> </td><td> </td><td> </td></tr><tr><td>1:1000</td><td>1.17</td><td>0.15</td><td>0.09</td></tr><tr><td>1:5000</td><td>0.46</td><td>0.03</td><td>0</td></tr><tr><td>1:25000</td><td>0.12</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>1μg/ml</td><td> </td><td> </td><td> </td></tr><tr><td>1:1000</td><td>＞2</td><td>0.25</td><td>0.10</td></tr><tr><td>1:5000</td><td>0.91</td><td>0.12</td><td>0.01</td></tr><tr><td>1:25000</td><td>0.25</td><td>0.01</td><td>0</td></tr><tr><td>0.1μg/ml</td><td> </td><td> </td><td> </td></tr><tr><td>1:1000</td><td>0.42</td><td>0.13</td><td>0.13</td></tr><tr><td>1:5000</td><td>0.11</td><td>0.03</td><td>0.02</td></tr><tr><td>1:25000</td><td>0.03</td><td>0</td><td>0</td></tr>
（1）抗体免疫球蛋白用包被缓冲液稀释至蛋白浓度为10、1和0.1μg/ml，分别在酶联免疫吸附剂测定板上进行包被，每一浓度包括三个纵行，洗涤。
（4）加底物显色。加酸终止反应后，读取A值。
（5）以强阳性抗原的A值在0.8左右、阴性参考的A值小于0.1的条件作最适条件，据此选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度。从表15-2可看出包被抗体浓度可选用1μg/ml，酶标抗体的稀释度可选为1:5000。为了进一步节省试剂，可以此浓度为基点，缩小间距再做进一步的棋盘[[滴定]]。 === 测定方法的标准化===
要使酶联免疫吸附剂测定测定得到准确的结果，不论是定性的还是定量的，必须严格按照[[规定]]的方法制备试剂和实施测定。主要试剂的制备要点已如前述，其他一般性试剂，如包被缓冲液、洗涤液、标本稀释液、结合物稀释液、底物工作液和酶反应终止液等，配制时不可掉以轻心。缓冲液可于冰箱中[[短期]]保存，使用前应观察是否变质。[[蒸馏水]]的质量在酶联免疫吸附剂测定中也至关重要，最好使用新鲜重蒸馏的。不合格的蒸馏水可使空白值升高。
测定的实施中，应力求各个步骤操作的标准化，下面以板式酶联免疫吸附剂测定为例，介绍有关注意事项。 ==== （一）加样==== 在酶联免疫吸附剂测定中除了包被外，一般需进行45加样。在定性测定中有时不强调加样量的准确性，例如规定为加样一滴。此时应该使用相同口径的滴管，保持准确的加样[[姿势]]，使每滴液体的体积基本相同。在定量测定中则加样量应力求准确。标本和结合物的稀释液应按规定配制。加样时应将液体加在孔底，避免加在孔壁上部，并注意不可出现气泡。 ==== （二）保温==== 在酶联免疫吸附剂测定中一般有二次[[抗原抗体反应]]，即加标本后和加结合物后，此时反应的温度和时间应按规定的要求，保温容器最好是水浴箱，可使温度迅速平衡。各酶联免疫吸附剂测定板不应叠在一起。为避免[[蒸发]]，板上应加盖，或将板平放在底部垫有湿纱布的湿盒中。湿盒应该是[[金属]]的，传热容易。如用保温箱，空湿盒应预先放在其中，以平衡温度，这在室温较低时更为重要。加入底物后，反应的时间和温度通常不做严格要求。如室温高于20℃，酶联免疫吸附剂测定板可避光放在实验台上，以便不时观察，待对照管显色适当时，即可终止酶反应。 ==== （三）洗涤====
洗涤在酶联免疫吸附剂测定过程中不是反应聚，但却是决定实验成败的关键。洗涤的目的是洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯待塑料对蛋白质的吸附作用是普遍性的。因此在酶联免疫吸附剂测定测定的反应过程中应尽量避免非特异性吸附，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。在标本和结合物的稀释液和洗涤液中加入聚山梨酯（吐温，Tween）一类物质即右达到此目的。聚山梨酯是聚氧[[乙烯]]去水[[山梨醇]][[脂肪酸]]酯，为非[[离子]]型的[[表面张力]]物质，常作为助[[溶剂]]。根据脂肪酸的种类而对聚山梨酯编号，结合[[月桂酸]]的为[[聚山梨酯20]]，在酶联免疫吸附剂测定中最为常用。它的洗涤效果好，并具有减少非特异性吸附和增强抗原抗体结合的作用。
洗涤如不彻底，特别在最后一次，如有酶结合物的非特异性吸附，将使空白值升高。另外，在间接法中如血清标本内的非特异性IgG吸附在固相上而未被洗净，也将与酶标抗体作用而产生干扰。
酶联免疫吸附剂测定板的洗涤一般可采用以下方法：①吸干孔内反应液；②将洗涤液注满板孔；③放置2min，略作摇动；④吸干孔内液，也可倾去液体后在[[吸水]]纸上拍干。洗涤的次数一般为3～4次，有时甚至需洗5～6次。 ==== （四）比色====
如阴性对照颜色极浅，在定性测定中一般可采用目视比色。如用比色计测定结果，准确性决定于酶联免疫吸附剂测定板底的平整与透明度和比色计的质量。
