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3. 多肽合成仪的发展
a) 第一代多肽合成仪
第一代多肽合成仪是以Beckman公司推出的Beckman 990 Peptide Synthesizer以及Vega’s Biotechnologies公司推出的Vega’s 296 Peptide Synthesizer为代表的,诞生在上世纪七十年代。
虽然随着生产工艺的改进和发展,如今第一代多肽合成仪已全部退出了市场。但1990年以前的众多肽化学文献都是在此实验设备上运行研发而来,第一代的多肽合成仪为之后的合成仪研发与制造产生了重大意义。
b) 第二代多肽合成仪
第二代多肽合成仪是以Protein Technologies公司推出的PS3 Peptide Synthesizer以及Advanced ChemTech公司推出的ACT peptide synthesizer Model 90为代表的,诞生在上世纪八十年代。此两款设备也是目前市场上仍在销售的最早的多肽合成仪。
PS3 的设计原理是采用氮气鼓泡的反应方式来对反应物进行搅拌,即合成仪上反应器是固定的,氮气从反应器的下方通过反应器到上部排出,在这一过程中产生的汽泡把固相和液相混合起来。这样设计的好处是结构简单,成本低,但反应相对温和:1)有时候多肽-固相载体在静电作用下会“抱团”,使其不能与液相充分混合,在这种情况下需要调高氮气的压力以消除静电作用;而在静电作用消除后要把压力立刻调低,不然的话较高的压力会把多肽-固相载体“吹”到反应器液面上方。由于多肽-固相载体具有较强的粘壁性,一旦被粘到反应器液面上方就再也无法下来,也就是无法再参加反应。显然第一代机器是无法自动作这样的压力调整的,这就是造成反应“死角”的重要原因。反应死角会降低多肽合成的效率和多肽的纯度,有的甚至造成合成的失败。2)长时间氮气鼓泡会使溶液挥发,液面降低后一部分多肽-固相载体就粘在液面上方,也无法再参加反应。3)氮气消耗量大,运行成本增大。
2. 基本元件
a) 反应器 Reaction Vessel
数百年来,制药业的反应器/反应釜 设备以玻璃材质最为常见,因其完全透明且耐腐蚀,而被众多化学、生物学专家沿用。多肽合成的过程需要操作人员直观监测,同时合成后可进行在线切割(切割试剂TFA的强腐蚀性对反应器材质有了极大限制),这些要求限制反应器以玻璃材质最为适用。
而玻璃材质的反应器在制造工艺上有极大的难度限制:①烧制工艺:磨口精度要求极高,正如很多国产设备都无法达到要求出现漏液漏气现象,玻璃壁均匀程度等。②配合搅拌柄以及密封装置的成套加工工艺③防爆处理
b) 氨基酸储罐 Amino Acid Reservoirsc) 溶剂储罐 Solvent Reservoirsd) 量筒 Metering Vessele) 转液瓶 Transfer Vesself) 感应器 Sensor
多端触发器自感应定量量取法,直观、科学、相对误差最低。
g) 废液桶 Waste Carboy
废液桶通常选择容积较大的HDPE桶,保证通风良好,同时需安装感应器装置时刻检测废液情况,避免溢出。
3. 控制配件
a) 电磁阀 Valves
多肽合成仪中的电磁阀属于敏感配件,其控制液路的串联与闭路,在氨基酸转移与量取,溶剂转移与量取两步骤中起到至关重要的作用。不同品牌的合成仪对电磁阀的设计与排布也略有不同。如PTI合成仪中,电磁阀成矩阵式排列,便于观察,但若发生堵塞情况则又有维修的不便,一个电磁阀堵塞则可能造成整块矩阵式电磁阀全部更换;CSBio合成仪中电磁阀采取Normally Close 方式,在非溶液转移操作过程中,电磁阀闭合,减少了污染与堵塞的发生,整体呈管路式排布;ABI433合成仪的电磁阀为7位组合,万一出现堵塞情况则整组更换,查找检修时非常方便,但成本也相对高了6倍。
b) 控制面板 Control Box
控制面板内往往含有光敏组建,部分控制电磁阀以及感应器控制组。与电脑主机的控制系统、合成仪统一的链接在一起,完成多肽合成的全过程。
c) 软件系统 Operating Software
多肽合成仪的操作软件。不同品牌合成仪所注册的软件也不同。
4. 检测方法
a) UV Monitor
在多肽合成仪中,在线检测耦合效果的装置,如UV Monitor往往是选配装置,客户可根据实验的需要选购。其功能是让操作者直观的看到多肽合成的每一部氨基酸偶联效果,从而针对特定的序列做合成设置的调整,最终达到最佳合成效果。
对于不熟悉多肽合成仪操作的用户来说,UV Monitor是相当重要的。
b) 试剂检测:没有选购在线检测附件的多肽合成仪用户,也可以采用试剂检测方法做基本的耦合效果测定实验。
固相多肽合成中,主要是通过检测树脂上游离氨基来判断连接效率,检测方法称为Kaiser方法,其检测结果,如果有游离氨基的时候,显示兰色,或红褐色(pro,ser,His)。
Kaiser试剂包括:A,6% 茚三酮的乙醇溶液;B,80% 苯酚的乙醇溶液;C,2% 0.001M KCN的吡啶溶液
配制中的吡啶需要经过茚三酮处理后,重蒸后再使用。检测过程,取少量树脂,加入A,B,C各2-3滴,100℃下加热1-2min,如果溶液有兰色,或树脂出现兰色,红褐色,表明还有游离氨基,否则说明连接完全。
c) 其它检测游离氨基的方法:三硝基苯磺酸法,苦味酸法,溴芬兰法等。
四、专利文件
五、选购指南
1. 科研单位考虑因素
a) 设备本身对实验研究的帮助
①对于多肽合成化学反应,使用设备可避免人手工操作对人体的伤害(试剂腐蚀)
②由于程序化设定,可保证每步骤偶合反应的充分性以及实验整体的稳定性
研究型多肽合成仪需满足循环式氨基酸添加位置多于20个,在夜间以及周末,预先配好的保护氨基酸可根据程序设置自动偶联并替换新的位置,保证了实验的效率,完全实现全自动!
⑤即使实验进行了很多年,更换了很多研究人员,实验数据还可以保存在电脑中。
b) 国际国内相关研究人员使用该多肽合成仪进行的有效研究结果
多肽合成仪的制造商应提供其公开发表的研究性论文多篇。 为进行多肽合成实验的学生们提供研究数据并使其模拟合成过程,更好的体验机械操作多肽合成的全步骤,检测自己的合成结果。
c) 多肽合成仪设备的专利保护对今后研究结果的影响
考虑到高等院校实验研究的严密性,结合对后期研发成果的保护机制,通常采购的设备需要具有其国际专利许可,以确保实验研究项目的顺利申报。
d) 制造商的生产规模
制造商的品牌、生产规模以及其所拥有的生产资格认证,都从侧面反映了其供应设备的质量、信誉以及对客户的服务保证。
2. 生产企业考虑因素
参考科研单位选购小型设备的考虑因素,对于生产型企业,使用不同品牌的多肽合成仪往往还应考虑其连贯完整的设备生产线,从小型合成规模至生产型合成规模的各种设备齐全。通常大型设备可根据反应器大小判断其合成规模,通常可在线切割的玻璃材质反应器/反应釜需达100L,可保证批量产数十公斤的多肽产品。