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== 重组B亚单位／菌体霍乱疫苗（肠溶胶囊）药典标准==
品名 中文名
重组B亚单位／菌体霍乱疫苗（肠溶胶囊） 汉语拼音
Chongzu B Yadanwei/Junti
Huoluan Yimiao（Changrongjiaonang） 英文名
Recombinant B-subunit/Whole
Cell Cholera Vaccine（Enteric-coated
Capsule） 定义、组成及用途
本[[品系]]将[[霍乱]][[毒素]]B亚单位[[基因重组]][[质粒]]（pMM-CTB）转化[[大肠杆菌]]MM2，使其高效表达霍乱毒素B亚单位（CTB），经纯化、冻干制成千粉；O1群[[霍乱弧菌]]经培养、[[灭活]]、冻干制成菌粉。将两者混合后加入适宜[[辅料]]制成[[肠溶胶囊]]，用于预防霍乱和产[[毒性]]大肠杆菌[[旅行者腹泻]]。 1 基本要求
生产和检定用设施、[[原材料]]及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”及国家生物安全防护的有关[[规定]]。 2 制造 2.1 原液 2.1.1 混合前原液
2.1.1.1 霍乱菌体[[原液]]
应符合本[[品种]]附录1“霍乱菌体原液[[制造]]及检定要求”中1项的规定。
2.1.1.2 [[重组]]霍乱毒素B亚单位原液
应符合本品种附录2“重组霍乱毒素B亚单位原液制造及检定要求”中1项的规定。 2.1.2 原液检定
2.1.2.1 霍乱菌体原液
应符合本品种附录1“霍乱菌体原液制造及检定要求”中2项的规定。
2.1.2.2 重组霍乱毒素B亚单位原液
应符合本品种附录2“重组霍乱毒素B亚单位原液制造及检定要求”中2项的规定。 2.1.3 原液冻干
2.1.3.1 霍乱菌体冻干粉
将霍乱菌体原液用稀释液稀释后，冷冻[[干燥]]制成菌粉。
2.1.3.2 重组霍乱毒素B亚单位冻干粉
将重组霍乱毒素B亚单位原液用稀释液稀释后，冷冻干燥制成冻干粉。 2.2 半成品 2.2.1 配制
将霍乱菌体冻干粉、重组霍乱毒素B亚单位冻干粉与适
宜辅料按一定比例混匀制成[[药粉]]，使每粒（240mg）含霍乱菌体5.0×1010个，重组霍乱毒素B亚单位1mg，用于制备胶囊。 2.2.2 半成品检定
按3.1项进行。
2.3 成品 2.3.1 分批
应符合“[[生物制品分批规程]]”的规定。 2.3.2 分装
应符合“[[生物制品]]分装和冻干规程”及附录Ⅰ F有关规定。 2.3.3 规格
每粒胶囊装量240mg，含霍乱菌体5.0×1010个，重组霍乱毒素B亚单位1mg。 2.3.4 包装
应符合“[[生物制品包装规程]]”及附录IF有关规定。 3 检定 3.1 半成品检定微生物限度
依法[[检查]]（[[2010年版药典三部附录Ⅻ]] G），每1g[[半成品]][[细菌]]数不得超过1000个，[[霉菌]]和[[酵母菌]]数不得超过100个，不得检出[[大肠]]埃希菌。 3.2 成品检定 3.2.1 鉴别试验
3.2.1.1 染色镜检
应为革兰氏阴性弧形[[杆菌]]。
3.2.1.2 [[免疫]]双[[扩散]]法
采用免疫双扩散法（[[2010年版药典三部附录Ⅷ]] C），供试品应与兔抗CTB[[血清]]产生与对照品一致的沉淀线。 3.2.2 物理检查
3.2.2.1 外观胶囊内药粉为淡黄色或浅褐色均匀粉末。
3.2.2.2 装量差异
依法检查（[[2010年版药典三部附录Ⅰ]] F），应符合规定。 3.2.3 崩解时限
依法检查（[[2010年版药典三部附录Ⅴ]] C），应符合规定。 3.2.4 干燥失重
依法检查（[[2010年版药典三部附录Ⅶ]] L），胶囊内容物在80℃干烤至[[恒重]]，减失重量应不得超过5.0%。 3.2.5 重组霍乱毒素B亚单位（CTB）含量测定
采用免疫单扩散法测定，CTB含量应为标示量的100%～200%。
用0.9%[[氯化钠]][[溶液]]将霍乱毒素B亚单位（CTB）[[标准品]]稀释至适宜稀释度，将胶囊内容物用0.9%氯化钠溶液稀释至每1ml含CTB约30μ9的供试品溶液，分别加入含适量CTB[[抗血清]]的[[凝胶]]板中，置湿盒中于37℃孵育扩散适宜时间，染色至沉淀圈显色清晰，用[[脱色]][[液脱]]去背景颜色后，[[测量]]各沉淀圈的直径，以标准品浓度对[[数值]]为纵坐标，对应沉淀圈直径的平均值为横坐标作直线回归，求得直线回归方程。将供试品沉淀圈直径代入回归方程，计算供试品的浓度。 3.2.6 微生物限度
按3.1项进行。 3.2.7 免疫力试验
采用间接[[酶联免疫法]][[检测]]免疫组小鼠血清[[抗体]]水平，与对照组小鼠血清相[[比较]]，免疫组小鼠霍乱弧菌抗体滴度应不低于对照组4倍，免疫组小鼠CTB抗体滴度应不低于对照组8倍。
取胶囊内容物，用[[磷酸]]盐[[缓冲液]]（pH 7.4）稀释至每1ml含菌1.0×109个，免疫[[体重]]10～12g小鼠至少10只，每只腹腔注射2次，每次0.5ml（含菌5.0×108个），间隔7天；对照组[[注射液]]为磷酸盐缓冲液（pH 7.4）。末次免疫后3～7天眼窝取血，[[分离]]血清并将免疫组各只小鼠血清和对照组各只小鼠血清分别等量混合。用含10%小[[牛血]]清和0.1% Tween-20的磷酸盐缓冲液（pH 7.4）将上述血清分别稀释400倍待用。将上述[[免疫血清]]稀释至适宜稀释度，以未免疫组小鼠血清为对照，采用间接酶联免疫法分别测定免疫血清中霍乱弧菌抗体和CTB抗体。计算对照组小鼠血清[[OD]]值的均值（X）+3SD，选取免疫组小鼠血清系列稀释度中OD值大于对照组X+3SD的最大稀释倍数，以此最大稀释倍数除以对照组血清稀释倍数得到免疫组小鼠抗体滴度倍数。
4 保存、运输及有效期
于2～8℃干燥[[保存]]和运输。自生产之日起，[[有效期]]24个月。 5 附录
附录1 霍乱菌体原液制造及检定要求
附录2 重组霍乱毒素B亚单位原液制造及检定要求 6 使用说明
应符合“生物制品包装规程”规定和批准的内容。 附录1 霍乱菌体原液制造及检定要求
本品系用O1群古典生物型或Eltor生物型霍乱弧菌经培养、加入[[甲醛溶液]]杀菌后冻干制成，用于制备重组B亚单位／菌体霍乱疫苗（肠溶胶囊）。 1 制造 1.1 菌种
生产用[[菌种]]应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的有关规定。
采用霍乱弧菌O1群古典生物型16012菌株或Eltor生物型18001菌株。来源于中国[[医学]]细菌[[保藏]]管[[理中]]心。 1.1.2 种子批的建立
应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的有关规定。 1.1.3 种子批的传代
[[主种子批]]菌种启开后[[传代]]次数不得超过5代；[[工作种子批]]菌种启开后至接种生产用[[培养基]]传代次数不得超过5代。 1.1.4 种子批的检定
主种子批应进行以下全面检定，工作种子批应进行1.1.4.1～1.1.4.3（1）项检定。
1.1.4.1 培养特性及染色镜检
将待检菌种接种于pH 7.8～8.2的肉汤[[琼脂]]或其他适宜培养基，置37℃培养18～24小时，应为光滑，半透明的圆形[[菌落]]。涂片染色镜检应为革兰氏阴性短小弧杆菌。
1.1.4.2 [[生化]][[反应]]
[[发酵]]甘露糖和[[蔗糖]]，产酸不产气，不发酵[[阿拉伯糖]]。
1.1.4.3
血清学试验
（1）用[[特异性]]血清作玻片[[凝集反应]]时，应与本型血清相凝集。
（2）用霍乱弧菌O多价诊断血清（原[[效价]]不低于1: 640）与18～24小时的O1霍乱弧菌培养物以[[生理氯化钠溶液]]稀释成细菌悬液（每1ml含菌1.8×109左右）进行定量凝集试验，凝集效价应不低于原血清效价之半。
1.1.4.4 [[毒力]]试验
将37℃培养8～16小时的培养物刮入30.0g/L碱性蛋白胨水中，比浊后用[[胃膜素]]或其他适宜稀释液稀释成不同浓度的菌悬液。每个浓度的菌悬液用体重18～20g小鼠5只，每只腹腔注射0.5ml，观察3天。计算[[LD]]50应不超过2×108个菌。
1.1.4.5 [[抗原性]]试验
选体重约2.0kg的家兔3只，[[静脉]]注射3次，每次0.5ml，第1次注射含菌1.0×109，第二次注射含菌2.0×109，第三次注射含菌3.0×109，每次间隔7天，末次注射后10～14天[[采血]]做定量凝集试验，2/3家[[兔血]]清之凝集效价达到1: 2000（+）即为合格。 1.1.5 种子批的保存
[[原始种子批]]和主代[[种子]]批应冻干保存于室温。工作种子批为半固体穿刺管室温保存，保存时间24个月。 1.2 原液
制造霍乱[[疫苗]]应用O1群古典生物型或Eltor生物型霍乱弧菌（根据流行情况确定）。 1.2.1 生产用种子
启开工作种子批菌种，接种LB培养基，制备生产用工作种子。 1.2.2 生产用培养基
采用改良M9培养基。生产用培养基不得含有使人产生[[毒性反应]]或[[变态反应]]的物质。 1.2.3 培养收获
1.2.3.1 培养以液体培养法培养的种子液，用[[无菌操作]]注入培养罐内，37℃培养，种子罐4～8小时，发酵罐6～10小时。
1.2.3.2 纯菌检查
培养物涂片进行[[革兰氏染色]]镜检，应为革兰氏阴性短小弧杆菌，若镜检发现有杂菌[[生长]]，应废弃。
1.2.3.3 杀菌
加入终浓度不超过1% （ml/ml）的甲醛溶液，于37℃杀菌2～3天。 1.2.3.4 杀菌检查
纯菌试验合格的菌液，应[[取样]]接种不含琼脂的硫[[乙醇]]酸盐培养基，琼脂斜面及碱性琼脂斜面各1管，于37℃培养5天，若有菌生长应废弃。 1.2.3.5 收获
用0.45μm膜进行切向流[[超滤]]浓缩获取菌体，超滤后用[[灭菌]]生理氯化钠溶液连续洗涤，并制成菌悬液分装于容器中。
2 检定 2.1 染色镜检
应为典型革兰氏阴性短小弧杆菌。 2.2 凝集试验
与霍乱弧菌O多价诊断血清作玻片[[定性]]凝集试验，呈阳性反应。 2.3 无菌检查
依法检查（2010年版药典三部附录Ⅻ A），应符合规定。另加试1%碱性蛋白胨水培养基1管，于30～35℃培养，应[[无菌]]生长。 2.4 浓度测定
按“中国细菌浊度标准”测定，每1ml含菌应为5.0×1011～1.05×1012。 2.5 游离甲醛残留量
每5.0×1010菌中含游离[[甲醛]]不得过0.16mg（2010年版药典三部附录Ⅶ）。 2.6 霍乱毒素残留量
采用间接[[ELISA法]]检测霍乱毒素（[[CT]]）残留量，每5.0×1010菌中含霍乱毒素不得过10ng。
以[[神经节]]苷脂（GMl）[[包被]]，用适宜稀释液将霍乱毒素对照品和供试品稀释至适宜浓度测定。以对照品溶液吸光度对其相应的浓度进行4-参数方程拟合，将供试品OD值代入4-参数方程拟合得到供试品中CT含量。 3 保存及有效期
于2～8℃保存，自收菌之日起保存时间不超过6个月。 附录2 重组霍乱毒素B亚单位原液制造及检定要求
本品系将霍乱毒素B亚单位基因重组质粒（pMM-CTB）转化大肠杆菌MM2，使其高效表达霍乱毒素B亚单位（CTB），纯化后用于配制重组B亚单位／菌体霍乱疫苗（肠溶胶囊）。 1 制造 1.1 工程菌菌种
重组霍乱毒素B亚单位工程菌株系由霍乱毒素B亚单位的[[重组质粒]]（pMM-CTB）转化的大肠杆菌E.Coli MM2菌株。 1.1.2 种子批的建立
应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定。 1.1.3 种子批的传代
主种子批菌种启开后传代次数不得超过5代；工作种子批菌种启开后至接种生产用培养基传代次数不得超过5代。 1.1.4 菌种检定
主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。
1.1.4.1 培养特性
应呈典型大肠杆菌集落[[形态]]，无其他杂菌生长。
1.1.4.2 染色镜检
应为典型的革兰氏阴性杆菌。
1.1.4.3 对[[抗生素]]的抗性
在含[[氨苄青霉素]]为50μg/ml的培养基[[上正]]常生长。
1.1.4.4 电镜检查（工作种子批可免做）
应为典型的大肠杆菌形态，无支原体、[[病毒]]样颗粒及其他[[微生物]][[污染]]。
1.1.4.5 生化反应
应符合大肠杆菌[[生物学]][[性状]]。
1.4.4.6 重组霍乱毒素B亚单位表达量
用LB培养基或生产用培养基在摇床中培养后，获得的培养物上[[清液]]采用间接ELISA法检测，以神经节苷脂（GMl）包被，以兔抗CTB血清为一抗，[[辣根]]过氧化酶标记的羊抗兔抗体为二抗。检测结果应为[[强阳]]性，P/[[N值]]应大于10。
1.1.4.7 质粒检查
工程菌用快速[[方法]]或其他适宜方法提取[[DNA]]，以琼脂糖凝胶[[电泳]][[分析]]应检出一个[[大小]]为5.1kb的质粒。该质粒用Xba Ⅰ和EcoR
Ⅰ双酶切后在琼脂糖凝胶电泳分析时应分别检出2.4kb和2.7kb的DNA带。电泳图谱应与原始重组质粒相符。
1.1.4.8 [[目的基因]][[核苷酸]]序列检查（工作种子批可免做）
目的基因核苷酸序列应与批准的序列相符。 1.2 原液 1.2.1 生产用种子
1.2.1.1 将检定合格的工作种子批菌种接种于含氨苄青霉素（100μg/ml）
LB[[斜面培养]]基，于32℃培养过夜，供种子罐接种用。
1.2.1.2 在灭菌LB培养基[[中接]]种种子液，种子罐35℃培养3～8小时，供发酵罐接种用。 1.2.2 生产用培养基
采用不含任何抗生素的改良的M9培养基。 1.2.3 接种和培养
1.2.3.1 在灭菌发酵培养基中接种种子液。
1.2.3.2 35℃[[通气]]搅拌发酵培养，异丙基-β-硫代[[半乳糖]]苷（IPTG）诱导后培养8～12小时。 1.2.4 收获
调节发酵液至适宜pH，连续离心，流速不高于每分钟1000ml，收集上清液。 1.2.5 纯化
将上清液稀释至适宜电导率后，进行阳[[离子]]交换[[层析]]纯化，采用含磷酸盐缓冲液[[洗脱]]目标蛋白，在280nm波长下检测层析峰，收集目标峰，得到CTB纯化液。 1.2.6 浓缩
采用适宜截留[[分子]]量的超滤膜，浓缩CTB溶液浓度到0.7mg/ml以上。 1.2.7 除菌过滤
将CTB浓缩液进行除菌[[过滤]]，分装于适宜容器中，即为CTB原液，于2～8℃保存。
2 原液检定 2.1 CTB浓度测定
用0.9%氯化钠溶液将原液稀释至每1ml含CTB约30μg，按正文3.2.5项进行，CTB浓度应不低于0.7mg/ml。 2.2 电泳纯度
依法测定（[[2010年版药典三部附录Ⅳ]] C），用还原型[[SDS]]-[[聚丙烯酰胺凝胶电泳]]法，分离胶胶浓度为15%，加样量应不低于2.5μg（考马斯亮蓝R250染色法）。经扫描仪扫描，纯度应不低于95.0%。 2.3 分子量
依法测定（2010年版药典三部附录Ⅳ C），用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为15%，加样量应不低于0.5μg，分子量应为11.6kD±1.2kD。 2.4 抗生素残留量
依法检查（[[2010年版药典三部附录Ⅸ]] A），不应有残余氨苄青霉素活性。 2.5 等电点
依法测定（2010年版药典三部附录Ⅳ D），主区带等电点应为7.2～8.2，且供试品的等电点图谱应与对照品一致。 2.6 紫外光谱
依法检查（[[2010年版药典三部附录Ⅱ]] A），在光路1cm、波长230～360nm下进行扫描，最大[[吸收]]峰波长应为279nm±3nm。 2.7 肽图
供试品的肽图谱应与相应对照品的肽图谱一致。
取供试品适量，用[[乙酸]]乙酸钠缓冲液（pH 3.8）制成每1ml含4mg的溶液，于25℃放置72小时。取此液50μl，加Tris溶液（pH 10.9）150μl，Tris-乙酸缓冲液（pH 8.5）100μl，[[胰蛋白酶]]溶液[TPCK处理，用1mol/L乙酸－乙酸钠缓冲液（pH 5.0）制成每1ml含1mg的溶液]40μl，混匀。置37℃水浴24小时后，加40μl冰乙酸终止反应，于10000转／分钟离心3分钟，依法测定（2010年版药典三部附录Ⅷ E），其中色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，柱温为45℃，流速为每分钟0.5ml，按下表进行[[梯度洗脱]]（表中A为0.1%[[三氟乙酸]]的水溶液，B为0.1%三氟乙酸的[[乙腈]]溶液）。
时间（分钟）
流动相A%（V/V）
流动相B%（V/V）
0
100
0
10
95
5
30
75
25
45
65
35
60
55
45
2.8 无菌检查
依法检查（2010年版药典三部附录Ⅻ A），应符合规定。 2.9 N端氨基酸序列（至少每年测定一次）
用[[氨基酸]]序列分析仪测定，N端序列应为：[[Thr]]-Pro-[[Gln]]-Asn-[[Ile]]-Thr-[[Asp]]-[[Leu]]-[[Cys]]-[[Ala]]-[[Glu]]-[[Tyr]]-[[His]]-Asn-Thr
3 保存及有效期
于2～8℃保存，原液自采集之日起保存时间不超过6个月。 版本
《[[中华人民共和国药典]]》2010年版 第二增补本
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品名 中文名
重组B亚单位／菌体霍乱疫苗（肠溶胶囊） 汉语拼音
Chongzu B Yadanwei/Junti
Huoluan Yimiao（Changrongjiaonang） 英文名
Recombinant B-subunit/Whole
Cell Cholera Vaccine（Enteric-coated
Capsule） 定义、组成及用途
本[[品系]]将[[霍乱]][[毒素]]B亚单位[[基因重组]][[质粒]]（pMM-CTB）转化[[大肠杆菌]]MM2，使其高效表达霍乱毒素B亚单位（CTB），经纯化、冻干制成千粉；O1群[[霍乱弧菌]]经培养、[[灭活]]、冻干制成菌粉。将两者混合后加入适宜[[辅料]]制成[[肠溶胶囊]]，用于预防霍乱和产[[毒性]]大肠杆菌[[旅行者腹泻]]。 1 基本要求
生产和检定用设施、[[原材料]]及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”及国家生物安全防护的有关[[规定]]。 2 制造 2.1 原液 2.1.1 混合前原液
2.1.1.1 霍乱菌体[[原液]]
应符合本[[品种]]附录1“霍乱菌体原液[[制造]]及检定要求”中1项的规定。
2.1.1.2 [[重组]]霍乱毒素B亚单位原液
应符合本品种附录2“重组霍乱毒素B亚单位原液制造及检定要求”中1项的规定。 2.1.2 原液检定
2.1.2.1 霍乱菌体原液
应符合本品种附录1“霍乱菌体原液制造及检定要求”中2项的规定。
2.1.2.2 重组霍乱毒素B亚单位原液
应符合本品种附录2“重组霍乱毒素B亚单位原液制造及检定要求”中2项的规定。 2.1.3 原液冻干
2.1.3.1 霍乱菌体冻干粉
将霍乱菌体原液用稀释液稀释后，冷冻[[干燥]]制成菌粉。
2.1.3.2 重组霍乱毒素B亚单位冻干粉
将重组霍乱毒素B亚单位原液用稀释液稀释后，冷冻干燥制成冻干粉。 2.2 半成品 2.2.1 配制
将霍乱菌体冻干粉、重组霍乱毒素B亚单位冻干粉与适
宜辅料按一定比例混匀制成[[药粉]]，使每粒（240mg）含霍乱菌体5.0×1010个，重组霍乱毒素B亚单位1mg，用于制备胶囊。 2.2.2 半成品检定
按3.1项进行。
2.3 成品 2.3.1 分批
应符合“[[生物制品分批规程]]”的规定。 2.3.2 分装
应符合“[[生物制品]]分装和冻干规程”及附录Ⅰ F有关规定。 2.3.3 规格
每粒胶囊装量240mg，含霍乱菌体5.0×1010个，重组霍乱毒素B亚单位1mg。 2.3.4 包装
应符合“[[生物制品包装规程]]”及附录IF有关规定。 3 检定 3.1 半成品检定微生物限度
依法[[检查]]（[[2010年版药典三部附录Ⅻ]] G），每1g[[半成品]][[细菌]]数不得超过1000个，[[霉菌]]和[[酵母菌]]数不得超过100个，不得检出[[大肠]]埃希菌。 3.2 成品检定 3.2.1 鉴别试验
3.2.1.1 染色镜检
应为革兰氏阴性弧形[[杆菌]]。
3.2.1.2 [[免疫]]双[[扩散]]法
采用免疫双扩散法（[[2010年版药典三部附录Ⅷ]] C），供试品应与兔抗CTB[[血清]]产生与对照品一致的沉淀线。 3.2.2 物理检查
3.2.2.1 外观胶囊内药粉为淡黄色或浅褐色均匀粉末。
3.2.2.2 装量差异
依法检查（[[2010年版药典三部附录Ⅰ]] F），应符合规定。 3.2.3 崩解时限
依法检查（[[2010年版药典三部附录Ⅴ]] C），应符合规定。 3.2.4 干燥失重
依法检查（[[2010年版药典三部附录Ⅶ]] L），胶囊内容物在80℃干烤至[[恒重]]，减失重量应不得超过5.0%。 3.2.5 重组霍乱毒素B亚单位（CTB）含量测定
采用免疫单扩散法测定，CTB含量应为标示量的100%～200%。
用0.9%[[氯化钠]][[溶液]]将霍乱毒素B亚单位（CTB）[[标准品]]稀释至适宜稀释度，将胶囊内容物用0.9%氯化钠溶液稀释至每1ml含CTB约30μ9的供试品溶液，分别加入含适量CTB[[抗血清]]的[[凝胶]]板中，置湿盒中于37℃孵育扩散适宜时间，染色至沉淀圈显色清晰，用[[脱色]][[液脱]]去背景颜色后，[[测量]]各沉淀圈的直径，以标准品浓度对[[数值]]为纵坐标，对应沉淀圈直径的平均值为横坐标作直线回归，求得直线回归方程。将供试品沉淀圈直径代入回归方程，计算供试品的浓度。 3.2.6 微生物限度
按3.1项进行。 3.2.7 免疫力试验
采用间接[[酶联免疫法]][[检测]]免疫组小鼠血清[[抗体]]水平，与对照组小鼠血清相[[比较]]，免疫组小鼠霍乱弧菌抗体滴度应不低于对照组4倍，免疫组小鼠CTB抗体滴度应不低于对照组8倍。
取胶囊内容物，用[[磷酸]]盐[[缓冲液]]（pH 7.4）稀释至每1ml含菌1.0×109个，免疫[[体重]]10～12g小鼠至少10只，每只腹腔注射2次，每次0.5ml（含菌5.0×108个），间隔7天；对照组[[注射液]]为磷酸盐缓冲液（pH 7.4）。末次免疫后3～7天眼窝取血，[[分离]]血清并将免疫组各只小鼠血清和对照组各只小鼠血清分别等量混合。用含10%小[[牛血]]清和0.1% Tween-20的磷酸盐缓冲液（pH 7.4）将上述血清分别稀释400倍待用。将上述[[免疫血清]]稀释至适宜稀释度，以未免疫组小鼠血清为对照，采用间接酶联免疫法分别测定免疫血清中霍乱弧菌抗体和CTB抗体。计算对照组小鼠血清[[OD]]值的均值（X）+3SD，选取免疫组小鼠血清系列稀释度中OD值大于对照组X+3SD的最大稀释倍数，以此最大稀释倍数除以对照组血清稀释倍数得到免疫组小鼠抗体滴度倍数。
4 保存、运输及有效期
于2～8℃干燥[[保存]]和运输。自生产之日起，[[有效期]]24个月。 5 附录
附录1 霍乱菌体原液制造及检定要求
附录2 重组霍乱毒素B亚单位原液制造及检定要求 6 使用说明
应符合“生物制品包装规程”规定和批准的内容。 附录1 霍乱菌体原液制造及检定要求
本品系用O1群古典生物型或Eltor生物型霍乱弧菌经培养、加入[[甲醛溶液]]杀菌后冻干制成，用于制备重组B亚单位／菌体霍乱疫苗（肠溶胶囊）。 1 制造 1.1 菌种
生产用[[菌种]]应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的有关规定。
采用霍乱弧菌O1群古典生物型16012菌株或Eltor生物型18001菌株。来源于中国[[医学]]细菌[[保藏]]管[[理中]]心。 1.1.2 种子批的建立
应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的有关规定。 1.1.3 种子批的传代
[[主种子批]]菌种启开后[[传代]]次数不得超过5代；[[工作种子批]]菌种启开后至接种生产用[[培养基]]传代次数不得超过5代。 1.1.4 种子批的检定
主种子批应进行以下全面检定，工作种子批应进行1.1.4.1～1.1.4.3（1）项检定。
1.1.4.1 培养特性及染色镜检
将待检菌种接种于pH 7.8～8.2的肉汤[[琼脂]]或其他适宜培养基，置37℃培养18～24小时，应为光滑，半透明的圆形[[菌落]]。涂片染色镜检应为革兰氏阴性短小弧杆菌。
1.1.4.2 [[生化]][[反应]]
[[发酵]]甘露糖和[[蔗糖]]，产酸不产气，不发酵[[阿拉伯糖]]。
1.1.4.3
血清学试验
（1）用[[特异性]]血清作玻片[[凝集反应]]时，应与本型血清相凝集。
（2）用霍乱弧菌O多价诊断血清（原[[效价]]不低于1: 640）与18～24小时的O1霍乱弧菌培养物以[[生理氯化钠溶液]]稀释成细菌悬液（每1ml含菌1.8×109左右）进行定量凝集试验，凝集效价应不低于原血清效价之半。
1.1.4.4 [[毒力]]试验
将37℃培养8～16小时的培养物刮入30.0g/L碱性蛋白胨水中，比浊后用[[胃膜素]]或其他适宜稀释液稀释成不同浓度的菌悬液。每个浓度的菌悬液用体重18～20g小鼠5只，每只腹腔注射0.5ml，观察3天。计算[[LD]]50应不超过2×108个菌。
1.1.4.5 [[抗原性]]试验
选体重约2.0kg的家兔3只，[[静脉]]注射3次，每次0.5ml，第1次注射含菌1.0×109，第二次注射含菌2.0×109，第三次注射含菌3.0×109，每次间隔7天，末次注射后10～14天[[采血]]做定量凝集试验，2/3家[[兔血]]清之凝集效价达到1: 2000（+）即为合格。 1.1.5 种子批的保存
[[原始种子批]]和主代[[种子]]批应冻干保存于室温。工作种子批为半固体穿刺管室温保存，保存时间24个月。 1.2 原液
制造霍乱[[疫苗]]应用O1群古典生物型或Eltor生物型霍乱弧菌（根据流行情况确定）。 1.2.1 生产用种子
启开工作种子批菌种，接种LB培养基，制备生产用工作种子。 1.2.2 生产用培养基
采用改良M9培养基。生产用培养基不得含有使人产生[[毒性反应]]或[[变态反应]]的物质。 1.2.3 培养收获
1.2.3.1 培养以液体培养法培养的种子液，用[[无菌操作]]注入培养罐内，37℃培养，种子罐4～8小时，发酵罐6～10小时。
1.2.3.2 纯菌检查
培养物涂片进行[[革兰氏染色]]镜检，应为革兰氏阴性短小弧杆菌，若镜检发现有杂菌[[生长]]，应废弃。
1.2.3.3 杀菌
加入终浓度不超过1% （ml/ml）的甲醛溶液，于37℃杀菌2～3天。 1.2.3.4 杀菌检查
纯菌试验合格的菌液，应[[取样]]接种不含琼脂的硫[[乙醇]]酸盐培养基，琼脂斜面及碱性琼脂斜面各1管，于37℃培养5天，若有菌生长应废弃。 1.2.3.5 收获
用0.45μm膜进行切向流[[超滤]]浓缩获取菌体，超滤后用[[灭菌]]生理氯化钠溶液连续洗涤，并制成菌悬液分装于容器中。
2 检定 2.1 染色镜检
应为典型革兰氏阴性短小弧杆菌。 2.2 凝集试验
与霍乱弧菌O多价诊断血清作玻片[[定性]]凝集试验，呈阳性反应。 2.3 无菌检查
依法检查（2010年版药典三部附录Ⅻ A），应符合规定。另加试1%碱性蛋白胨水培养基1管，于30～35℃培养，应[[无菌]]生长。 2.4 浓度测定
按“中国细菌浊度标准”测定，每1ml含菌应为5.0×1011～1.05×1012。 2.5 游离甲醛残留量
每5.0×1010菌中含游离[[甲醛]]不得过0.16mg（2010年版药典三部附录Ⅶ）。 2.6 霍乱毒素残留量
采用间接[[ELISA法]]检测霍乱毒素（[[CT]]）残留量，每5.0×1010菌中含霍乱毒素不得过10ng。
以[[神经节]]苷脂（GMl）[[包被]]，用适宜稀释液将霍乱毒素对照品和供试品稀释至适宜浓度测定。以对照品溶液吸光度对其相应的浓度进行4-参数方程拟合，将供试品OD值代入4-参数方程拟合得到供试品中CT含量。 3 保存及有效期
于2～8℃保存，自收菌之日起保存时间不超过6个月。 附录2 重组霍乱毒素B亚单位原液制造及检定要求
本品系将霍乱毒素B亚单位基因重组质粒（pMM-CTB）转化大肠杆菌MM2，使其高效表达霍乱毒素B亚单位（CTB），纯化后用于配制重组B亚单位／菌体霍乱疫苗（肠溶胶囊）。 1 制造 1.1 工程菌菌种
重组霍乱毒素B亚单位工程菌株系由霍乱毒素B亚单位的[[重组质粒]]（pMM-CTB）转化的大肠杆菌E.Coli MM2菌株。 1.1.2 种子批的建立
应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定。 1.1.3 种子批的传代
主种子批菌种启开后传代次数不得超过5代；工作种子批菌种启开后至接种生产用培养基传代次数不得超过5代。 1.1.4 菌种检定
主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。
1.1.4.1 培养特性
应呈典型大肠杆菌集落[[形态]]，无其他杂菌生长。
1.1.4.2 染色镜检
应为典型的革兰氏阴性杆菌。
1.1.4.3 对[[抗生素]]的抗性
在含[[氨苄青霉素]]为50μg/ml的培养基[[上正]]常生长。
1.1.4.4 电镜检查（工作种子批可免做）
应为典型的大肠杆菌形态，无支原体、[[病毒]]样颗粒及其他[[微生物]][[污染]]。
1.1.4.5 生化反应
应符合大肠杆菌[[生物学]][[性状]]。
1.4.4.6 重组霍乱毒素B亚单位表达量
用LB培养基或生产用培养基在摇床中培养后，获得的培养物上[[清液]]采用间接ELISA法检测，以神经节苷脂（GMl）包被，以兔抗CTB血清为一抗，[[辣根]]过氧化酶标记的羊抗兔抗体为二抗。检测结果应为[[强阳]]性，P/[[N值]]应大于10。
1.1.4.7 质粒检查
工程菌用快速[[方法]]或其他适宜方法提取[[DNA]]，以琼脂糖凝胶[[电泳]][[分析]]应检出一个[[大小]]为5.1kb的质粒。该质粒用Xba Ⅰ和EcoR
Ⅰ双酶切后在琼脂糖凝胶电泳分析时应分别检出2.4kb和2.7kb的DNA带。电泳图谱应与原始重组质粒相符。
1.1.4.8 [[目的基因]][[核苷酸]]序列检查（工作种子批可免做）
目的基因核苷酸序列应与批准的序列相符。 1.2 原液 1.2.1 生产用种子
1.2.1.1 将检定合格的工作种子批菌种接种于含氨苄青霉素（100μg/ml）
LB[[斜面培养]]基，于32℃培养过夜，供种子罐接种用。
1.2.1.2 在灭菌LB培养基[[中接]]种种子液，种子罐35℃培养3～8小时，供发酵罐接种用。 1.2.2 生产用培养基
采用不含任何抗生素的改良的M9培养基。 1.2.3 接种和培养
1.2.3.1 在灭菌发酵培养基中接种种子液。
1.2.3.2 35℃[[通气]]搅拌发酵培养，异丙基-β-硫代[[半乳糖]]苷（IPTG）诱导后培养8～12小时。 1.2.4 收获
调节发酵液至适宜pH，连续离心，流速不高于每分钟1000ml，收集上清液。 1.2.5 纯化
将上清液稀释至适宜电导率后，进行阳[[离子]]交换[[层析]]纯化，采用含磷酸盐缓冲液[[洗脱]]目标蛋白，在280nm波长下检测层析峰，收集目标峰，得到CTB纯化液。 1.2.6 浓缩
采用适宜截留[[分子]]量的超滤膜，浓缩CTB溶液浓度到0.7mg/ml以上。 1.2.7 除菌过滤
将CTB浓缩液进行除菌[[过滤]]，分装于适宜容器中，即为CTB原液，于2～8℃保存。
2 原液检定 2.1 CTB浓度测定
用0.9%氯化钠溶液将原液稀释至每1ml含CTB约30μg，按正文3.2.5项进行，CTB浓度应不低于0.7mg/ml。 2.2 电泳纯度
依法测定（[[2010年版药典三部附录Ⅳ]] C），用还原型[[SDS]]-[[聚丙烯酰胺凝胶电泳]]法，分离胶胶浓度为15%，加样量应不低于2.5μg（考马斯亮蓝R250染色法）。经扫描仪扫描，纯度应不低于95.0%。 2.3 分子量
依法测定（2010年版药典三部附录Ⅳ C），用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为15%，加样量应不低于0.5μg，分子量应为11.6kD±1.2kD。 2.4 抗生素残留量
依法检查（[[2010年版药典三部附录Ⅸ]] A），不应有残余氨苄青霉素活性。 2.5 等电点
依法测定（2010年版药典三部附录Ⅳ D），主区带等电点应为7.2～8.2，且供试品的等电点图谱应与对照品一致。 2.6 紫外光谱
依法检查（[[2010年版药典三部附录Ⅱ]] A），在光路1cm、波长230～360nm下进行扫描，最大[[吸收]]峰波长应为279nm±3nm。 2.7 肽图
供试品的肽图谱应与相应对照品的肽图谱一致。
取供试品适量，用[[乙酸]]乙酸钠缓冲液（pH 3.8）制成每1ml含4mg的溶液，于25℃放置72小时。取此液50μl，加Tris溶液（pH 10.9）150μl，Tris-乙酸缓冲液（pH 8.5）100μl，[[胰蛋白酶]]溶液[TPCK处理，用1mol/L乙酸－乙酸钠缓冲液（pH 5.0）制成每1ml含1mg的溶液]40μl，混匀。置37℃水浴24小时后，加40μl冰乙酸终止反应，于10000转／分钟离心3分钟，依法测定（2010年版药典三部附录Ⅷ E），其中色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，柱温为45℃，流速为每分钟0.5ml，按下表进行[[梯度洗脱]]（表中A为0.1%[[三氟乙酸]]的水溶液，B为0.1%三氟乙酸的[[乙腈]]溶液）。
时间（分钟）
流动相A%（V/V）
流动相B%（V/V）
0
100
0
10
95
5
30
75
25
45
65
35
60
55
45
2.8 无菌检查
依法检查（2010年版药典三部附录Ⅻ A），应符合规定。 2.9 N端氨基酸序列（至少每年测定一次）
用[[氨基酸]]序列分析仪测定，N端序列应为：[[Thr]]-Pro-[[Gln]]-Asn-[[Ile]]-Thr-[[Asp]]-[[Leu]]-[[Cys]]-[[Ala]]-[[Glu]]-[[Tyr]]-[[His]]-Asn-Thr
3 保存及有效期
于2～8℃保存，原液自采集之日起保存时间不超过6个月。 版本
《[[中华人民共和国药典]]》2010年版 第二增补本
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