细胞毒试验
操作名称
细胞毒试验
用品及准备
材料
①50μl加样器；②250μl加样器；③微量反应板；④倒置显微镜；⑤医用液体石蜡油；⑥尼龙纤维棉和聚乙稀塑料管(管径6mm，长160mm)。
试剂
①抗血清。
③5%伊红-Y溶液。
④12%福马林（pH7.0~7.4）。
⑤对照组：阳性对照，用兔抗人淋巴细胞血清和抗B淋巴细胞血清；阴性对照，灭活正常人AB型混合血清。
⑥淋巴细胞分离液（比重1.077±0.02）。
⑦Hanks液（pH6.8~7.4）。
⑧20%小牛血清-RPM1640培养液。
⑨淋巴细胞洗涤液和淋巴细胞保存液。
方法及内容
(1)向Terasaki反应板的每孔加10μl液体石蜡油。
(2)每反应板最后两孔分别加阳性和阴性对照血清，其余每孔加已知或待检血清1μl。
(3)每孔加的淋巴细胞悬液或B淋巴细胞悬液1μl，并轻轻摇动，使其与抗血清完全混匀。
(4)室温(20℃±2℃)培养30min，B细胞置于37℃温育箱1h。
(5)每孔加兔补体5μl，充分混匀，室温培养1h，B细胞2h。
(6)每孔加入5％伊红Y3μl，作用1～3min。
(7)每孔加入12％福马林8μl，室温静置1～2h或4℃冰箱过夜，置显微镜下观察结果。
注意事项
对淋巴细胞毒试验方法有影响的因素很多，所以一般需做多个复本。
(1)淋巴细胞：①纯度：沾染的颗粒细胞可吸收抗体，红细胞及血小板可使计数时间减慢，而引起计数误差。②浓度：细胞浓度过低，无法计数，其准确性大大下降，细胞浓度大，造成淋巴细胞集聚成团，影响结果。③pH值：中性为宜，过酸影响细胞致敏，过碱易造成假阳性。
(2)抗血清：细胞溶解和抗血清效价低也是引起计数误差的常见原因。
(3)加入补体要充足，以克服抗补体因子。
(4)染料：离心除去沉淀物与杂质。
(5)控制培养温度与时间。
结果判读
(1)使用倒置相差显微镜观察，计数每孔死细胞百分数。死细胞因透进了伊红Y染料色暗晦，无折光性，大而无立体感；活细胞有折光性，小而光亮。
(2)结果判读标准：1＝细胞死亡0～10％；2＝细胞死亡11％～20％；4＝细胞死亡21％～40％；6＝细胞死亡41％～80％；8＝细胞死亡81％～100％。其中，1和2为阴性反应；4为可疑或弱阳性反应；6和8为阳性反应。
