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== 注射用重组人促红素（CHO细胞）药典标准==

Zhusheyong

Recombinant

重组人促红素工程[[细胞系]]由带有人促红素基因的[[重组质粒]][[转染]]的CHO-dhfr-（二氢[[叶酸]]还原酶基因缺陷型细胞）细胞系。 2.1.2 细胞库建立、传代及保存

由[[原始细胞库]]的细胞[[传代]]，扩增后冻存于液氮中，作为[[主细胞库]]；从主细胞库的细胞传代，扩增后冻存于液氮中，作为[[工作细胞库]]。各级[[细胞库]]细胞传代应不超过批准的代次。细胞冻存于液氮中，检定合格后方可用于生产。 2.1.3 主细胞库及工作细胞库细胞的检定

应符合“[[生物制品]]生产检定用动物细胞[[基质]]制备及检定规程”[[规定]]。 2.1.3.1 外源因子检查

[[细菌]]和[[真菌]]、支原体、[[病毒]][[检查]]均应为阴性。 2.1.3.2 细胞鉴别试验

应用[[同工酶]][[分析]]、[[生物化学]]、[[免疫学]]、[[细胞学]]和[[遗传]]标记物等任一[[方法]]进行鉴别，应为典型CHO细胞。 2.1.3.3 人促红素表达量

应不低于原始细胞库细胞的表达量。 2.1.3.4 目的基因核苷酸序列检查（工作种子批可免做）

[[目的基因]][[核苷酸]]序列应与批准的序列相符。

从工作细胞库来源的细胞复苏后，于含灭能新生[[牛血]]清培养液中进行传代、扩增，供转瓶或细胞培养罐接种用。新生牛血清的质量应符合规定（[[2010年版药典三部附录XIII]] D）。 2.2.2 生产用细胞培养液

生产用细胞培养液应不含牛血清和抗生素。 2.2.3 细胞培养

细胞培养全过程应严格按照[[无菌操作]]。细胞培养时间可根据细胞[[生长]]情况而定。 2.2.4 分离纯化

收集的培养液采用经批准的[[超滤法]]或其他适宜方法进行浓缩，多步色谱纯化后制得高纯度的重组人促红素，即为人促红素[[原液]]。除菌[[过滤]]后[[保存]]于适宜温度，并规定其[[有效期]]。 2.2.5 原液检定

原液加入适宜稳定剂，并用[[缓冲液]]稀释。除菌过滤后即为[[半成品]]。 2.3.2 半成品检定

应符合“[[生物制品分批规程]]”规定。 2.4.2 分装及冻干

应符合“生物制品分装和冻干规程”及[[2010年版药典三部附录Ⅰ]] A有关规定。半成品应及时分装、冷冻。冻干的全过程中，制品温度应不高于30℃。 2.4.3 规格

应为经批准的[[规格]]。 2.4.4 包装

用4g/L碳酸氢铵[[溶液]]将供试品稀释至0.5～2mg/ml，作为供试品溶液。以4g/L碳酸氢铵溶液作为空白，测定供试品溶液在320nm、325nm、330nm、335nm、340nm、345nm和350nm的吸光度。用读出的吸光度的对数与其对应波长的对数作直线回归，求得回归方程。照紫外一可见[[分光光度法]]（[[2010年版药典三部附录Ⅱ]] A），在波长276～280nm处，测定供试品溶液最大吸光度Amax，将Amax对应波长代入回归方程求得供试品溶液由于光散射产生的吸光度A光散射。按下式计算供试品[[蛋白质]]含量，应不低于0.5mg/ml。

3.1.2 生物学活性 3.1.2.1 体内法

依法测定（[[2010年版药典三部附录Ⅹ]] B）。 3.1.2.2 体外法

按[[酶联免疫法]]试剂盒说明书测定。 3.1.3 体内比活性

每Img蛋白质应不低于1.0×105IU。 3.1.4 纯度 3.1.4.1 电泳法

依法测定（[[2010年版药典三部附录Ⅳ]] C）。用非还原型[[SDS]]-[[聚丙烯酰胺凝胶电泳]]法，考马斯亮蓝染色，分离胶胶浓度为12.5%，加样量应不低于10μg，经扫描仪扫描，纯度应不低于98.0%。 3.1.4.2 高效液相色谱法

依法测定（[[2010年版药典三部附录Ⅲ]] B）。亲水硅[[胶体]]积排阻色谱柱，排阻极限300kD，孔径24nm，粒度10μm，直径7.5mm，长30cm;流动相为3.2mmol/L[[磷酸氢二钠]]－1.5mmol/L[[磷酸二氢钾]]－400.4mmol/L[[氯化钠]]，pH7.3；上样量应为20～100μg，在波长280nm处[[检测]]，以人促红素色谱峰计算的理论板数应不低于1500。按[[面积]]归一化法计算人促红素纯度，应不低于98.0%。 3.1.5 分子量

依法测定（2010年版药典三部附录Ⅳ C）。用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，考马斯亮蓝R250染色，分离胶胶浓度为12.5%，加样量应不低于1μg，[[分子]]质量应为36～45kD。 3.1.6 紫外光谱

依法测定（2010年版药典三部附录Ⅱ A），用水或[[生理氯化钠溶液]]将供试品稀释至0.5～2mg/ml，在光路1cm、波长230～360nm下进行扫描，最大[[吸收]]峰应为279nm±2nm;最小吸收峰应为250nm±2nm;在320～360nm处应无吸收峰。 3.1.7 等电聚焦

取[[尿素]]9g、30%[[丙烯酰胺]][[单体]]溶液6.0ml、40%

pH3～5的两性[[电解质]]溶液1.05ml、40% pH 3～10的两性电解质溶液0.45ml、水13.5ml，充分混匀后，加入N,N,N',N'-四甲基乙二胺15μl和10%[[过硫酸铵]]溶液0.3ml，[[脱气]]后制成[[凝胶]]，加供试品溶液20μl（浓度应在每1ml含0.5mg以上），照等电聚焦[[电泳法]]（2010年版药典三部附录Ⅳ D）进行，同时做对照。[[电泳]]图谱应与对照品一致。 3.1.8 唾液酸含量

每1mol人促红素应不低于10.0mol（[[2010年版药典三部附录Ⅵ]] C）。 3.1.9 外源性DNA残留量

每10000IU人促红素应不高于100pg（[[2010年版药典三部附录Ⅸ]] B）。 3.1.10 CHO细胞蛋白质残留量

采用双[[抗体]]夹心酶联免疫法检测，应不高于蛋白质总量的0.05%。 3.1.11 细菌内毒素检查

每10000IU人促红素应小于2EU（[[2010年版药典三部附录Ⅻ]] E凝胶限度试验）。 3.1.12 牛血清白蛋白残留量

依法测定（[[2010年版药典三部附录Ⅷ]] I），应不离于蛋白质总量的0.01%。 3.1.13 肽图

肽图应与人促红素对照品一致。 3.1.14 N端氨基酸序列（至少每年测定1次）

用[[氨基酸]]序列分析仪测定，N端序列应为：

[[Ala]]-Pro-Pro-[[Arg]]-[[Leu]]-[[Ile]]-[[Cys]]-[[Asp]]-[[Ser]]-Arg-[[Val]]-Leu-[[Glu]]-Arg-[[Tyr]]。

每1000IU人促红素应小于2EU（2010年版药典三部附录Ⅻ E凝胶限度试验）。 3.2.2 无菌检查

除复溶时间、[[水分]]测定和装量差异检查外，应按标示量加入[[灭菌注射用水]]，复溶后进行其余各项检定。 3.3.1 鉴别试验

按[[免疫印迹法]]（2010年版药典三部附录Ⅷ A）或[[免疫]]斑[[点法]]（2010年版药典三部附录Ⅷ B）测定，应为阳性。 3.3.2 物理检查 3.3.2.1 外观

应为白色疏松体，复溶后应为无色澄明液体。 3.3.2.2 复溶时间

加入标示量的灭菌注射用水，复溶时间应不超过2分钟。 3.3.2.3 可见异物

依法检查（[[2010年版药典三部附录Ⅴ]] B），应符合规定。 3.3.2.4 装量差异

依法检查（2010年版药典三部附录Ⅰ A），应符合规定。 3.3.3 化学检定 3.3.3.1 水分

应不高于3.0%（[[2010年版药典三部附录Ⅶ]] D）。 3.3.3.2 pH值

依法测定（2010年版药典三部附录Ⅴ A），应符合批准的要求。 3.3.3.3 钠离子含量

应不大于190mmol/L（2010年版药典三部附录Ⅶ J）。 3.3.3.4 人血白蛋白含量

若制品中加入[[人血白蛋白]]作稳定剂，则应符合批准的要求（2010年版药典三部附录Ⅵ B第二法）。 3.3.3.5 渗透压摩尔浓度

依法测定（2010年版药典三部附录Ⅴ H），应符合批准的要求。 3.3.4 生物学活性 3.3.4.1 体外法

按酶联免疫法试剂盒说明书测定，应为标示量的80%～120%。 3.3.4.2 体内法

依法测定（2010年版药典三部附录Ⅹ B），应为标示量的80%～140%。 3.3.5 无菌检查

依法检查（2010年版药典三部附录Ⅻ A），应符合规定。 3.3.6 细菌内毒素检查

每1000IU人促红素应小于2FU; 5000IU/支以上规格的人促红素，每支应小于10EU（2010年版药典三部附录Ⅻ E凝胶限度试验）。 3.3.7 异常毒性检查

依法检查（2010年版药典三部附录Ⅻ F小鼠试验法），应符合规定。

《[[中华人民共和国药典]]》2010年版