血清醛缩酶

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概述

醛缩酶ALDALS)系果糖-1,6-二磷酸D-甘油醛-3-磷酸裂解酶。该酶以1,6-二磷酸果糖(FDP)为底物,使其分解为3-磷酸甘油醛(GAP)和磷酸二羟丙酮(DAP);ALD也能以果糖-1-磷酸(F-1-P)为底物,相应地称为FDF ALD和F-1-P ALD。ALD广泛分布于各种动物组织中,其中以骨骼肌的活力最高,脑、心肌、肝次之,血清最低,红细胞中该酶活性比血清高15倍。ALD测定主要有比色法和酶偶联法。

血清醛缩酶医学检查

分类

血液生化检查 > 酶类测定

取材

血液

原理

(1)比色法:ALD可催化底物1,6-二磷酸果糖,分解为GAP和DAP。硫酸肼作捕获剂,与DAP和GAP形成棕。用碘醋酸抑制3-磷酸甘油醛脱氢酶,用碱水解成游离的二羟丙酮和甘油醛,并经分子重排形成甲基乙二醛。最后与酸性2,4-二硝基苯作用,生成2,4-二硝基苯腙,在碱性条件下呈紫红色,其颜色深浅与ALD活性呈正相关

(2)酶偶联法:在反应体系中加入磷酸丙糖异构酶(TPI)使GAP转变为DAP,加入甘油-1-磷酸脱氢酶(GDH)催化DAP还原,同时NADP氧化为NAD+。根据在340nm吸光度降低的速率,计算ALD活力。

试剂

(1)比色法:

①0.1mol/L三甲基吡啶缓冲液(pH7.4):称2,4,6-三甲基吡啶1.21g或吸取1.32ml,溶于蒸馏水50ml中,用1mol/L HCl调pH至7.4(约3~4ml),并稀释至100ml。因三甲基吡啶易挥发,应经常校pH。

②0.56mol/L硫酸肼溶液(pH7.4):称硫酸肼(NH2-NH2·H2SO4)7.29g,溶于60ml 1mol/L NaOH中,调pH至7.4,用水稀释至100ml。

③2mmol/L碘醋酸溶液(pH7.4):称碘醋酸37mg,溶于0.1mol/L NaOH 2ml中,用水稀释至100ml。

④50mmol/L 1,6-二磷酸果糖底物液(pH7.4):称取1,6-二磷酸果糖二钠盐384mg,溶于10ml蒸馏水中,用1mol/L NaOH调pH至7.4,以蒸馏水稀释至20ml。冰箱保存可用2周。

⑤100g/L三氯乙酸

⑥0.75mol/L NaOH溶液。

⑦1g/L DNPH溶液:称取DNPH 100mg,用2mol/L HCl溶解并稀释至100mL。

⑧2g/L二羟丙酮贮存标准液:准确称取二羟丙酮200mg,用蒸馏水溶解并稀释至100ml,置冰箱中48~72h充分解聚后使用。

⑨0.2g/L二羟丙酮应用标准液:将贮存标准液用蒸馏水做10倍稀释。

(2)酶偶联法:

①底物缓冲液:称220mg Na2FDP·8H2O(或370mg三环已氨FDP·H2O),6.2mg碘醋酸,溶于90ml蒸馏水中,加入0.75ml 2,3,6-三甲基吡啶,混合,用5mol/L HCl调pH至7.4(约0.6ml),用蒸馏水稀释至100ml。2~8℃可稳定4周。此液含三甲基吡啶55mmol/L,碘醋酸0.3mmol/L,FDP 4mmol/L。

②15mmol/L NADH溶液:称25mg Na2NADH及20mg NaHCO3,溶于2ml蒸馏水中,2~8℃稳定4周。

③GDH/TPI/LDH悬液(Boehfinger Mannheim公司产品):用3.2mol/L硫酸铵溶液稀释成混合酶溶液,使各酶浓度为甘油-1-磷酸脱氢酶(GDH)>75KU/L、磷酸丙糖异构酶(TPI)>500KU/L,乳酸脱氢酶(LDH)>233 KU/L(25℃),2~8℃均可稳定1年,用前充分混匀。

操作方法

(1)比色法:按表1操作。

混匀,10min后用540nm波长,蒸馏水调零,读取各管吸光度,以测定管吸光度减去对照管吸光度之差值,查标准曲线求出醛缩酶单位。

附注:

①FDP有各种盐类,称量时应按分子量计算其相当的量。用其钙盐或钡盐时,须先溶于1mol/L盐酸,再逐滴加入饱和硫酸钠溶液,使钙或钡安全沉淀,离心后取上清液用1mol/L NaOH调pH至7.4。最后稀释至规定的容量。

②本法标准曲线不成直线,故不宜作标准管直接计算。

③血清中ALD非常稳定,4℃最少可稳定5天,-20℃可保存6个月。也可用血浆标本,各种抗凝剂均无影响。血细胞中ALD活性很高,应尽快分离标本,勿溶血

(2)酶偶联法:

①取2.5ml底物缓冲液,0.05ml NADH溶液,0.01ml GDH/TPL/LDH混合酶液,0.2ml血清或血浆,放入比色杯中。

②混合,37℃温育5min。

③在340nm波长读取吸光度A1。

④37℃再准确温育20min后(第2步的5min不算在内),在340nm波长下读取吸光度A2。

⑤若△A(A1-A2)>0.50,用等渗盐水对标本进行5~10倍稀释后重测。

附注:

①本反应体系中加入LDH以除去内源性丙酮酸干扰。本法的线性范围至少可达180U/L。

②标本勿溶血,血清置室温可保存48h,4℃可保存3~4周,酶活性无显著变化。

③FDP在4~5mmol/L之间测ALD活性最高,更高的底物浓度可出现抑制现象。

正常值

(1)比色法:成人为5~27U/L,新生儿为成人的4倍,儿童约为成人的2倍。

(2)酶偶联法:男2.61~5.71U/L。女1.98~5.54U/L。

临床意义

血清ALD测定主要用于诊断肌肉和肝脏疾病。

(1)肌肉疾病:肌营养不良症多发性肌炎患者血清ALD活性升高。在肌营养不良症中,以假肥大型、肢带型和远端型的酶活性最高,肩肱型和眼肌型仅轻度升高或正常。通常,ALD活性随年龄增加而递减,在活动期和肌肉萎缩之前酶活力增高最显著,故其测定有助于本病的诊断。心肌梗死患者血清ALD活力升高,一般在胸痛发作24~48h达高峰,其变化规律与AST相同,但比AST改变要早。心绞痛时则正常。

(2)肝脏疾病:急性病毒性肝炎ALD活性的升降与ALT相平行。慢性肝炎、肝硬化阻塞性黄疸仅轻度升高。

相关疾病

肝硬化、黄疸


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