SARS冠状病毒
冠状病毒是一群具有套膜的RNA病毒，在电子显微镜下呈皇冠状，其正性单股RNA约由27000~30000多个碱基组成，为已知最大的RNA病毒，可感染人、鸡、猪、牛、鼠、猫等动物，会引发呼吸道与肠道的疾病，并引起人类轻微感冒。冠状病毒分为三大类，其中两类感染哺乳动物，另一类只感染鸟类，基本上这类病毒的宿主相当专一，主要引发呼吸道与肠道感染。2003年新发现的一种冠状病毒，为引起人类严重急性呼吸道症候群（SARS）。
严重急性呼吸综合征冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus：SARS CoV，SCoV SARS冠状病毒）属与环状病毒（torovirus）属同为动脉炎病毒科（arteriviridae），划作套病毒（nidovims）目。冠状病毒依其抗原性差异分为3群。SARSCoV与任何一群的同源性均显不高，有的研究者将其归属于2群。Ksiazek示它可能为两群的重组病毒。2005年6月Colorado会议提议将SCoV分类为2群。
SARS冠状病毒在种属分类上属于“ssRNA positive-strand viruses”家系的“Nidovirales”族中的“Coronaviridae”系(见Taxonomy)。它是冠状病毒家族中新出现的一个子类。全长29,736bp，已知有11个编码序列（cds），而其中的一个cds（putative orf1ab polyprotein）与鼠类的肝炎病毒（murine hepatitis virus）结构类似，依据鼠类的肝炎病毒的结构模式，推断出该段cds应该编码了14个蛋白质。
SARS冠状病毒概述
SARS冠状病毒(SARS-Cov)，属于巢状病毒目(Order: Nidovirales),冠病毒科(Family:Coronaviridae)，冠状病毒属(Genus: Coronavirus)。根据其基因组结构分类，它属于单链正义 RNA 病毒[(+)sense, ssRNA Virus]。
成熟的冠状病毒颗粒直径约为 60 至 220nm 不等。其形态学上最显著的特征在于，在病毒包膜(envelope)外，有明显的棒状膜外子粒('club-shaped' peplomers)。这一酷似中世纪欧洲帝王王冠(crown)的结构（如图 1），正是其”名字” - Coronavirus 的来源。
对其他已知冠状病毒的研究发现，其病毒包膜主要包括三种糖蛋白，分别命名为S 蛋白(Spike Protein)、M 蛋白(Membrane Protein)、E 蛋白(Envelope Protein)。在部分病毒株中还能找到一种 HE 蛋白(Haemagglutinin-esterase)。其中 S 蛋白即伸出包膜的棒-球形的糖蛋白，它在病毒与宿主细胞表面受体结合及介导膜融合进入细胞的过程中，起关键性作用，也是冠状病毒主要的抗原蛋白。M 蛋白则是一种跨膜蛋白，在病毒的包膜形成与出芽(budding)过程中起重要作用。E 蛋白是一种相对较小的蛋白质，主要散在分布于病毒包膜上。冠状病毒主要结构模式见图 。
冠状病毒入侵宿主细胞。冠状病毒的 S 蛋白是介导冠状病毒入侵宿主细胞的重要分子，
对其配体的研究亦成为关心焦点。目前认为有两类分子可能是冠状病毒的受体：氨基肽酶 N
（Aminopeptidase N）（图 3a）以及鼠类癌胚抗原细胞黏附分子 1（murine CEACAM1）（图
3b）。它们通过与冠状病毒 S 蛋白结合，诱导冠状病毒 S 蛋白发生结构上的变化，暴露穿膜
位于病毒颗粒中央的不规则核酸部分即病毒基因组，其上结合有核壳体蛋白(N蛋白，Nucleocapsid Protein)。冠状病毒基因组 RNA(Genomic RNA)是一个无分段的，正义单链 RNA，长度一般在 27-31kb。该 RNA 链具有一个正链 RNA 病毒特有的重要结构特征：即 RNA 链 5`端有甲基化帽(methylated cap)、3`端有 PolyA 尾的结构。这一结构，和真核mRNA 非常相近，也是其基因组 RNA 自身即可发挥翻译模板作用的重要结构基础。冠状病毒进入细胞后的转录、翻译、复制、装配与出芽过程，如图 4 所示。值得特别指出的是：冠状病毒成熟粒子中，并不存在RNA病毒复制所需的 RNA 聚合酶(Viral RNA polymerase)。因此，它进入宿主细胞之后，首先将直接以病毒基因组 RNA 为翻译模板，表达出病毒 RNA 聚合酶。然后才利用该酶完成负链亚基因组 RNA (sub-genomic RNA) 的转录合成、各结构蛋白 mRNA 的合成，以及病毒基因组 RNA 的复制。另一个需要说明的特点是：冠状病毒各个结构蛋白成熟的 mRNA 合成，并不存在转录后的修饰剪切过程，而是直接在初次转录过程中，通过 RNA 聚合酶和一些转录因子，以一种“不连续转录”(discontinuous transcription)的机制，通过识别特定的转录调控序列（transcriptionregulating sequences ，TSR），有选择性地从负义链 RNA 上，一次性转录得到构成一个成熟 mRNA 的全部组成部分。
结构蛋白和基因组 RNA 复制完成后，将在宿主细胞内质网处装配(assembly)生成新的冠状病毒颗粒，并通过高尔基体分泌至细胞外，完成其生命周期。
关于导致 SARS 的病原体，在其研究之初，全球各地的研究组曾经存在过多种推断。3月22日，香港大学微生物系首先利用非洲绿喉肾脏细胞(African Green Monkey KidneyCells, Vero E6)，从一个感染者的肺组织中分离到了一种未知的病毒，推测其很可能即为致病原。WHO 的研究网络随即集中对该病毒进行了分析，并且在3月27日的简报中首次提到了”病原体可能是冠状病毒的一种”。此后两周内，该研究网络的多个实验室对SARS进行了临床标本、病理组织与影像学、病毒分离培养、血清学与免疫学诊断、分子生物学与遗传同源性等多方面的深入研究与鉴定，最终确认：一种新的冠状病毒(Coronavirus)，
就是导致严重急性呼吸综合征的病原体！
SARS 冠状病毒基因组学研究
4月12日，加拿大 British Columbia Cancer Agency’s Genome Sciences Centre 首先完成了SARS 冠状病毒的全基因组测序(Accession Number: AY274119)。我国中国科学院华大基因组研究中心，也于4月16日完成了5个SARS病毒分离株的测序工作。截至5月9日，已提交到 GeneBank 的完整 SARS 基因组序列达11条。其基本信息见表 1。NCBI 参照上述各 序 列 ， 以Tor2基因组序列为蓝本 ， 修正给出了SARS的基因组参考序列(AC:NC_004718)。
表1.已完成测序的 SARS 冠状病毒全基因组序列 （截至 2003.5.9）
通过与已知冠状病毒基因组的比较分析，三个完成测序的研究组－USCCDC、加拿大BCCA 基因组研究所、北京华大基因组研究中心，分别基于 Urbani/Tor2/BJ01的序列，对 SARS冠状病毒的基因组结构进行了分析预测，并发表了各自的工作。三个病毒株的分析结果基本一致，认为 SARS 冠状病毒基因组属于典型的缺乏 HE 蛋白的冠状病毒[HE(-)-Coronavirus]
基因组结构。其基因组 5’端约三分之二的区域，编码病毒 RNA 聚合酶复合蛋白；后三分之一的区域，编码病毒结构蛋白，按基因组上的排列顺序依次为 S 蛋白、E 蛋白、M 蛋白、N蛋白；未发现 HE 蛋白编码序列。已发表的 USCDC、加拿大、北京华大的基因组结构图分别如图 5-7 所示。
上述三篇基因组分析论文10-12均指出在结构蛋白编码区可能的开放读码框(Open Reading Frame, ORF)中，存在已有蛋白质序列数据库中未找到任何同源序列的未知蛋白(Predicted Unknown Protein, PUP)。但是在具体的PUP数目和位置上，各组之间的结论存在一定的差异。其中USCDC对Urbani和北京华大对BJ01的分析，均报道发现了5个PUP；加拿大Tor2的分析则报道发现了9个可能的未知ORF和1个s2m motif。本研究在4月26日，即基于Genebank已有的基因组序列，参考 NCBI 的简要注释，对其进行了系统的同源性检索分析，并在第一时间发布，分析其结果与随后发表的上述三篇论文基本一致20。现以加拿大Tor2的分析结果为参照，将三地对于未知蛋白的结果罗列如下：
表2. Tor2 / Urbani /BJ01 基因组中未知蛋白 ORF 的预测对比
此外，加拿大和美国的研究组，均对冠状病毒基因组的5’端非翻译区(UTR)和各个 ORF起始密码子上游的区域进行了分析，以期待寻找到类似于其他冠状病毒”UCUAAAC”的，参与“不连续转录”识别的特征性TRS（转录调控序列）。两个研究组均在orf1a、S蛋白、X1(即 Tor2 ORF3 )、M 蛋白、X4（即 Tor2 ORF8）、X5(即 Tor2 ORF9)和 N 蛋白上游，发现了一个保守的8个核苷酸的 TRS――”AAACGAAC”。另外，加拿大的研究还显示在其他几个ORF上游，也有类似的TRS。(如表 3 所示)。上述发现，进一步支持了冠状病毒的不连续转录模型，也为ORF预测的准确性提供了强有力的证据。
另外，上述诸研究组的分析工作还发现了一些细节的结构现象。加拿大的研究提到在 3’端非编码区，存在一个保守的 s2m motif。这个在某些病毒中广泛存在的结构可能对于了解SARS 冠状病毒的来源有提示作用。中国 BJ01 的分析结果还发现了至少四个单位长度在 7个碱基以上的回文结构（palindromes）、140 多个可能形成发夹结构(hairpin)的片段，以及发现 BJ01 基因组上 155-211/861-920 这两个区域内的大约 60 个碱基出现重复现象12。上述有趣的基因组现象的生物学意义均有待进一步研究证实。
SARS CoV 突变与 SARS 系统发生关系(Phylogenetic)分析
由于 SARS 是一种突发的严重传染性疾病，短期内在多个国家均有感染及死亡报道。因此，分析比较不同地区 SARS 病毒的序列差异与突变状况，对于了解疾病的传染过程、病毒的毒力变化以及控制该疾病的传播，都具有非常重要的意义。另外，运用比较基因组学的方法，了解 SARS 冠状病毒与已知冠状病毒的系统发生关系，以确定 SARS Coronavirus 的可能来源与种属分类，也是 SARS 研究的重要课题。
本研究组于 4 月底，利用当时已发表的 9 个不同来源的 SARS 基因组序列，对其 S 蛋白的编码区序列多样性进行了分析，并以 S 蛋白质编码基因为对象，绘制出了序列已公布的几个 SARS 病毒株的系统发生树。5 月 1 日，在北京基因组中心提交 BJ01 全基因组序列之后，随即根据新的 5 条全基因组序列修正了上述 S 蛋白基因组序列突变分析，并进行了全基因组的碱基替换与氨基酸突变分析。所得结果，与北京基因组中心随后发表的论文所述基本一致(碱基替换分布如图 8)。
北京基因组中心在其发表的工作中，着重比较分析了 BJ01/Urbani/Tor2/CUHK/HKU 等五个病毒株全基因组的碱基替换(substitution)情况及其对编码氨基酸的影响。总共发现了31个碱基替换位点， 计算总突变率约为.0.10%； 其中有义突变(non-synonymous substitution)15个。具体突变的数目及分布情况见表 4。
表 4. BJ01/Urbani/Tor2/CUHK/HKU 全基因组碱基替换分析明细表
整体突变率显示，不同地源的SARS冠状病毒基因组，至少在上述病毒株采样期间，保持了相对稳定。从绝对数量上看，突变部位主要集中在RNA聚合酶区域，但是考虑到突变ORF的长度，则显示结构蛋白编码区的突变率要大大高于聚合酶编码区，未知蛋白质区域的突变率高于结构蛋白。这一结构上的突变分布规律，与病毒功能上的稳定性具有一定的一致性。
上述突变规律的研究，对于SARS冠状病毒的防治有着十分重要的意义：首先，RNA聚合酶的保守性，进一步证实了病毒 RNA 聚合酶合成的独立性，也提示RNA聚合酶可能为抗SARS药物设计提供重要靶点。抗HIV药物中的聚合酶抑制剂的成功思路，可能也适用于SARS冠状病毒。其次，S蛋白质的突变，尤其是高比例的有义突变(3/4)，提示S蛋白可能是病毒诱发机体免疫系统生成抗体，及发生细胞毒性的T细胞免疫反应的主要抗原蛋白。这对于了解SARS的急性损伤机制，制备SARS冠状病毒特异性抗体及疫苗，都有着十分重要的意义。
另外，新加坡基因组中心于5月9日发表了对14条SARS全长或部分基因组序列的比较分析结果，对世界各地 SARS病毒的突变及演化关系进行了深入分析。虽然由于其选用的BJ01的序列为5月 1 日修正之前的数据，使得其突变分析结果有待改进，但是他们对于各地SARS病毒相互之间演化关系的推断，还是具有相当重要的启发意义和较高参考价值的。
从上述分析工作来看，SARS 冠状病毒是一个比较稳定的病毒（但也不排除在未来其会有大规模的变异）。这个结果为我们提供了喜忧参半的信息：其稳定性有利于机体针对病毒特异性抗体的生成，降低二次感染可能性，并增加了疫苗研究的可行性；但同时也意味着病毒随传代毒力减低的可能性减小，给疾病的流行控制增加了难度。当然，要回答“SARS 病毒变还是不变？怎么变？”的问题，仅仅这些简单而有限的分析是远远不够的，还需要依赖于对不同地域、不同时间、不同感染者来源的更多病毒株的测序资料，以及更为广泛深入的临床与实验研究。
在系统发生(Phylogenetic)方面，已知的冠状病毒，根据血清学证据和种属发生学规律，分为 3 个 Group。其中 Group1，2 包括有多种哺乳动物冠状病毒，Group3 仅有鸟感染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus, IBV)。序列同源性的分析表明，SARS 冠状病毒与已知各种冠状病毒的同源性都不高（见表 5）。
因此，作为一种新发现的冠状病毒，确定SARS CoV的系统发生学位置与种属关系，是病毒学研究的重要课题。在缺乏血清学系统认证的情况下，前面提及的美、加、中三个研究组在发表各自基因组分析结果的同时，都基于核酸或冠状病毒重要编码蛋白的氨基酸序列，对SARS CoV进行了系统发生学分析(Phylogenetic Analyses)。北京研究组的系统发生树，是基于Genebank中已有收载的17种不同的冠状病毒 RNA 聚合酶的核酸和氨基酸序列；USCDC则利用全基因组序列已知的 7 种冠状病毒的6个重要蛋白质氨基酸序列，绘制系统发生树（见图 9），加拿大的工作与USCDC基本类似。上述工作均显示SARS CoV无法归于现有的任何一个Group，且在系统发生上与其他3个 Group 的成员基本上是等距离的。这一结果与序列同源比对的数据也是一致的。北京大学疾病基因研究中心生物信息组，在4月底也曾基于SARS CoV的S蛋白和orf1a序列，对其进行了同源比对和种系进化分析，其结论得到了随后发表论文的证实。
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