528,223
个编辑
更改
创建页面，内容为“1971年Engvall和Perlmann发表了ELISA（enzymelinkedimmunosorbentassay，酶联免疫吸附剂测定）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始...”
1971年Engvall和Perlmann发表了[[ELISA]]（enzymelinkedimmunosorbentassay，酶联免疫吸附剂测定）用于[[IgG]]定量测定的文章，使得1966年开始用于[[抗原]]定位的酶标[[抗体]]技术发展成液体[[标本]]中微量物质的[[测定方法]]。
== 酶联免疫吸附剂测定基本原理==
这一[[方法]]的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相[[载体]]表面，并[[保持]]其[[免疫]]活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起[[反应]]。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检[[物质的量]]成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接[[相关]]，故可根据颜色反应的深浅刊物[[定性]]或[[定量分析]]。由于酶的催化[[频率]]很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的[[敏感]]度。
== 方法类型和操作步骤==
酶联免疫吸附剂测定可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶[[作用]]的底物。根据试剂的来源和标本的[[性状]]以及[[检测]]的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。 （一）双抗体夹心法
双抗体夹心法（图15-4）是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：
图15-4双抗体夹心法测抗原示意图
（1）将[[特异性]]抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。
（2）加受检标本：使之与固相抗体[[接触反应]]一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。
（3）加酶标抗体：使固相[[免疫复合物]]上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。
（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。
根据同样原理，将[[大分]]子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。
（二）双位点一步法
在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原[[分子]]上两个不同[[抗原决定簇]]的[[单克隆抗体]]分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了[[反应时间]]，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的酶联免疫吸附剂测定提高到新水平。
图15-5双位点一步法示意图
在一步法测定中，应[[注意]]钩状[[效应]]（hookeffect），类同于[[沉淀反应]]中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。 （三）间接法测抗体
间[[接法]]（图15-6）是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的[[抗抗体]]以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：
（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。
（2）加稀释的受检[[血清]]：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他[[免疫球蛋白]]及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。
（3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。
（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。
本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。
图15-6间接法测抗体示意图 （四）竞争法
竞争法（图15-7）可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下：
（1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。
（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合[[溶液]]，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。
（3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。
图15-7竞争法测抗原示意图
（五）捕获法测IgM抗体
血清[[中针]]对某些抗原的特异性[[IgM]]常和特异性IgG同时存在，后者会[[干扰]]IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法（图15-8），先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下：
图15-8捕获法测IgM抗体示意图
（1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。
（2）加入稀释的血清标本：保温反应[[后血]]清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。
（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。
（4）加[[入针]]对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。
（5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。 （六）应用亲和素和生物素的酶联免疫吸附剂测定
亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个[[生物素]]分子亲密结合。现在使用更多的是从[[链霉菌]]中提取的链霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又称[[维生素]]H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的[[衍生物]]，生物素－[[羟基]][[琥珀]]亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与[[蛋白质]]、[[糖类]]和酶等多种类型的[[大小]]分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为[[稳定]]。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似[[晶格]]的复合体。因此把亲和素和生物素与ELIS偶联起来，就可大提高酶联免疫吸附剂测定的敏感度。
亲和素－生物素[[系统]]在酶联免疫吸附剂测定中的应用有多种形式，可用于间接[[包被]]，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用[[吸附]]法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规酶联免疫吸附剂测定中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，[[然后]]连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。桥联法ABC-酶联免疫吸附剂测定（avidinbiotincomplex-酶联免疫吸附剂测定）夹心法测抗原的过程见图15-9。
图15-9桥连法ABC-酶联免疫吸附剂测定夹心法测抗原示意图
== 酶联免疫吸附剂测定的技术要点==
酶联免疫吸附剂测定的技术要点包括三个方面：试剂的制备、反应条件的选择和操作的[[标准化]]。 试剂的制备
酶联免疫吸附剂测定的主要试剂为固相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体和与标记酶直接关联的酶反应底物。以下叙述这些试剂的原料和制备方法。 （一）固相载体
可作酶联免疫吸附剂测定中载体的物质很多，最常用的是聚[[苯乙烯]]。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的[[性能]]，抗体或蛋白质抗原吸附其上后保留原来的免疫活性。聚苯乙烯为[[塑料]]，可制成各种形式。在酶联免疫吸附剂测定测定过程中，它作为载体和容器，不参与化学反应。加之它的价格低廉，所以被普遍采用。
酶联免疫吸附剂测定载体的[[形状]]主要有三种：小试管、小珠和微量反应板。小试管的特点是还能兼作反应的容器，最[[后放]]入分光光度计中比色。小珠一般为直径0.6cm的圆球，表面经磨砂处理后吸附[[面积]]大增加。如用特殊的洗涤器，在洗涤过程中使圆珠滚动淋洗，效果更好。最常用的载体为微量反应板，专用于酶联免疫吸附剂测定测定的[[产品]]也称为酶联免疫吸附剂测定板，国际通用的标准板形是8×12的96孔式。为便于作少量标本的检测，有制成8联或12联孔条的，放入座架后，大小与标准酶联免疫吸附剂测定板相同。酶联免疫吸附剂测定板的特点是可以同时进行大量标本的检测，并可在特定的比色计上迅速读出结果。现在已有多种自动化仪器用于微量反应板型的酶联免疫吸附剂测定检测，包括加样、洗涤、保温、比色等步骤，对操作的标准化极为有利。
良好的酶联免疫吸附剂测定板应该是吸附性能好，空白值低，孔底[[透明度]]高，各板之间和同一板各孔之间性能相近。聚苯乙烯酶联免疫吸附剂测定板由于配料的不同和制作工艺的差别，各种产品的质量差异很大。因此每一[[批号]]的聚苯乙烯制品在使用前须[[检查]]其性能。常用的检查方法为：以一定浓度的人IgG（一般为10ng/ml）包被酶联免疫吸附剂测定板各孔后，每孔内加入适当稀释的酶标抗人IgG抗人IgG抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止酶反应后分别测每孔溶液的吸光度。[[控制]]反应条件，使各读数在0.8左右。计算所有读数的平均值。所有单个读数与平均读数之差应小于10％。
与聚苯乙烯类似的塑料为聚[[氯乙烯]]。作为酶联免疫吸附剂测定固相载体，聚氯乙烯板的特点为质软板薄，可切割，价廉、但光洁度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值有时也略高。
为[[比较]]不同固相在某一酶联免疫吸附剂测定测定中的优劣，可用以下方法加以[[检验]]：用其它[[免疫学]]测定方法选出一个典型的阳性标本和一个典型的阴性标本。将它们分别进行一系列稀释后，在不同的固相载体上按预定的酶联免疫吸附剂测定操作步骤进行测定，然后比较测定结果。在哪一种载体上阳性结果与阴性结果判别最大，这种载体就是这一酶联免疫吸附剂测定测定的最合适的固相载体。
除塑料制品外，固相酶免疫测定的载体还有两种材料：一是微孔滤膜，如[[硝酸]][[纤维素]]膜、[[尼龙]]膜等，这类测定形式将在本章第五节“膜载体的酶免疫测定”[[中介]]绍。另一种载体是以含铁的磁性微粒制作的，[[反应时]]固相微粒悬浮在溶液中，具有液[[相反]]应的速率，反应结束后用磁铁吸引作为[[分离]]的手段，洗涤也十分方便，但需配备特殊的仪器。
（二）抗原和抗体
在酶联免疫吸附剂测定实施过程中，抗原和抗体的质量是实验是否成功的关键因素。本法要求所用抗原纯度高，抗体[[效价]]高、亲和力强。
酶联免疫吸附剂测定所用抗原有三个来源：天然抗原、[[重组]]抗原和合成[[多肽]]抗原。天然抗原取材于动物[[组织]]或[[体液]]、[[微生物]]培养物等，一般含有多种抗原成分，需经纯化，提取出特定的抗原成分后才可应用，因此也称提纯抗原（purifiedantigen）。重组抗原（recombinantantigen）和多肽抗原（peptideantigen）均为人工合成品，使用安全，而且纯度高，[[干扰物]]质少。因此虽然制备合成抗原有较高的技术难度且要求较为昂贵的仪器设备和试剂，其应用仍十分普遍，特别是对那些天然抗原不易得到的试验，更显出其独到之处。
用于酶联免疫吸附剂测定的抗体有多[[克隆]]的和单克隆的。[[抗血清]]成分复杂，应从中提取IgG才可用于包被固相或酶标记。含单克隆抗体的小鼠[[腹水]]中的特异性抗体含量较高，有时可适当稀释后直接进行包被。制备酶结合物用的抗体的质量往往要求有较高的纯度。经[[硫酸]]铵[[盐析]]纯化的IgG可进一步用各种分子筛[[层析]]提纯。也可用亲和层析法提纯特异性IgG，如用酶[[消化]]IgG后提取的Fab片段，则效果更好。 （三）免疫吸附剂
固相的抗原或抗体称为免疫吸附剂。将抗原或抗体固相化的过程称为包被（coating）。由于载体的不同，包被的方法也不同。如以聚苯乙烯酶联免疫吸附剂测定板为载体，通常将抗原或抗体溶于[[缓冲液]]（最常用的为pH9.6的碳酸缓冲液）中，加于酶联免疫吸附剂测定板孔中在4℃过夜，经[[清洗]]后即可应用。如果包被液中的蛋白质浓度过低，固相载体表面有能被此蛋白质完全覆盖，其后加入的血清标本和酶结合物中的蛋白质也会部分地吸附于固相载体表面，最后产生非特异性显色而导致本底偏高。在这种情况下，如在包被后再用1％～5％[[牛血]]清[[白蛋白]]包被一次，可以消除这种干扰。这一过程称为封闭（blocking）。包被好的酶联免疫吸附剂测定板在低温可放置一段时间而不失去其免疫活性。
（四）酶和底物
酶联免疫吸附剂测定中所用的酶要求纯度高、催化反应的[[转化率]]高、专一性强、性质稳定、来源丰富、价格不贵、制备成的酶标抗体或[[抗原性]]质稳定，继续保留着它的活性部分和催化[[能力]]。最好在受检标本中不存在与标记酶相同的酶。另外它的相应底物应易于制备和[[保存]]，价格低廉，有色产物易于测定，光[[吸收]]高。酶联免疫吸附剂测定中最常用的酶为[[辣根]]过氧化酶（HRP）和从[[牛肠]]粘膜或[[大肠杆菌]]提取的[[碱性磷酸酶]]（[[AP]]）。
HRP在蔬菜[[作物]]辣根中含量很高，纯化方法也不复杂。它是一种糖蛋白，含糖量约18％；分子量为44kD；是一种[[复合酶]]，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成的一种[[卟啉]]蛋白质。主酶为无色糖蛋白，在275nm波长处有最高吸收峰；辅基是深棕色的含铁卟啉环，在403nm波长处有最高吸收峰。HRP催化下列反应：
上式中DH2为供氢体，H2O2O为受氢体。HRP对受氢体的专一性很高，除H2O2外，仅作用于[[小分]]子醇的[[过氧化物]]和[[尿素]]的过氧化物。后者为固体，作为试剂较H2O2方便。许多[[化合物]]可作为HRP的供氧体，在酶联免疫吸附剂测定中常用的供氢体底物为邻苯二胺（orthopenylenediamine，OPD）、四甲基[[联苯胺]]（3，3＇，5，5＇-tetramethylbenzidine，TMB）和ABTS[2，2＇-azino-bis（3-ethyl-benzthiazolinesulfonate-6）]。
OPD为在酶联免疫吸附剂测定中应用最多的底物，[[灵敏度]]高，比色方便。其缺点是配成应用液后稳定性差，而且具有致异[[变性]]。TMB无此缺点。TMB经酶作用后由无色变蓝色，目测对比鲜明；加酸停止酶反应后变黄色，可在比色计中定量；因此应用日见增多。ABTS，虽然灵敏度不如OPD和TMB，但空白值很低。HRP催化OPD的反应如下：
HRP的纯度用RZ（ReinheitZahl，意为纯度数）表示，是403nm的吸光度与280nm的吸光度之比，高纯度的HRP的RZ≥3.0。应注意的是酶变性后，RZ可不变而活力降低，故重用[[酶制剂]]时更重要的指标为活力。[[酶活力]]以单位表示：1min将1μmol的底物转化为产物的酶量为1个单位。
在酶联免疫吸附剂测定中另一常用的酶为碱性磷酸酶。从大肠杆菌提取的AP分子量为80kD，酶作用的最适pH为8.0；用小牛肠粘膜提取的AP分子量为100kD，最适pH为9.6。一般采用对[[硝基苯]][[磷酸]]酯（p-nitrophenylphosphate，p-NPP）作为底物。它可制成片状试剂，使用方便。产物为黄色的对[[硝基]]酚，在405nm有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一段时间。反应式如下：
在酶联免疫吸附剂测定中应用AP系统，其敏感性一般高于应用HRP系统，空白值也较低。但由于AP较难得到高纯度制剂，稳定性较HRP低，价格较HRP高，制备酶结合物时得率较HRP低等原因，国内在酶联免疫吸附剂测定中一般均采用HRP。
除HRP和AP以外，在商品酶联免疫吸附剂测定试剂中应用的酶尚有[[葡萄糖氧化酶]]、[[β-半乳糖苷酶]]和脲酶等。β-[[半乳糖]]苷酸的底物常用4-甲基伞基-β-D半乳糖苷（4-mehtyumbelliferyl-β-D-galactoside），经酶水解后产生[[荧光]]物质4-甲基伞酮（4-mehtylumbelliferone），可用荧光计检测。荧光的放大作用大大提高了方法的敏感度。AP也可应用可产生荧光的伞基磷酸酯作底物。其缺点是[[需要]]荧光计测定，而且如用固相载体直接作为测定容器，此载体不可发出荧光。脲酶的特点是酶作用后反应液[[发生]]pH改变，可使[[指示剂]]变色；另外，在[[人体]]内没有内源酶（酶的化学发光底物见第十八章）。
（五）结合物
酶标记的抗原或抗体称为结合物（conjugate）。抗原由于化学[[结构]]不同，可用不同的方法与酶结合。如为蛋白质抗原，基本上可参考[[抗体酶]]标记的方法。制备抗体酶结合物的方法通常有以下几种。
1．[[戊二醛]]交联法戊二醛是一种双[[功能]]团试剂，可以使酶与蛋白质或其他抗原的[[氨基]]通过它而偶联。戊二醛交联可用一步法（如连接AP），也可用二步法（如连接HRP）。举例如下：
2～5mg纯抗体与5mgAP混合于0.1mol/LpH6.8的磷酸缓冲液1ml中，4℃下对同上缓冲液[[透析]][[平衡]]。磁力搅拌下，缓慢加入1％戊二醛0.05ml，在室[[温下]]放置2小时。在4℃下对0.05mol/LpH8.0Tris缓冲液透析平衡，即得酶标抗体。
辣根过氧化物酶可[[溶解]]于50％饱和度硫酸铵中。用上法交联后可用50％饱和度硫酸铵沉淀酶标抗体，弃去上清中游离酶。
戊二醛一步法操作简便、有效，而且[[重复性]]好。缺点是交联时分子间的比例不严格，大小也不一，影响效果。
制备HRP抗体结合物也可用二步法，即先将HRP与戊二醛作用，透析除去戊二醛，在pH9.5缓冲液中再与抗体作用而形成酶标抗体。此法的效率可高于一步法10倍左右。
2．过[[碘酸]]盐氧化法本法只用于HRP的交联。该酶含18％[[碳水化合物]]，过碘酸盐将其分子表面的[[多糖]]氧化为[[醛基]]。用[[硼氢化钠]]（NaBH4）中和多余的过碘酸。酶上的醛根很活泼，可与蛋白质结合，形成[[按摩]]尔比例结合的酶标结合物。有人认为此法为辣根过氧化物酶交联最有效的方法。但也有只认为由于所用试剂较为剧烈，各批实验结果不易重复。
按以上方法制备的结合物一般混有未结合的酶和抗体。理论上结合物中混有游离酶不影响酶联免疫吸附剂测定中最后的[[酶活性]]测定，因经过洗涤，非特异性吸附于固相上的游离酶已被洗去。但游离的抗体则会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，因而减低结合到固相上的酶标抗体量。因此制备的结合物应予以纯化。纯化的方法较多，分离大分子[[混合物]]的方法均可应用。硫酸铵[[盐析法]]操作简便，但效果不如用SephadexG-200[[凝胶]][[过滤]]的好。
最适工作浓度的选择
在建立某一酶联免疫吸附剂测定测定中，应对包被抗原或抗体的浓度和酶标抗原或抗体的浓度予以选择，以达到最合适的测定条件和节省测定费用。下面以间接法测抗体和夹心法测抗原为例，介绍最适工作浓度的选择方法。 （一）间接法测抗体
1．酶标抗抗体工作浓度的选择
（1）用100ng/ml人IgG进行包被，洗涤。
（2）将酶标抗人IgG用稀释液作一系列稀释后分别加入已包被的孔中，保温、洗涤。
（3）加底物显色。加酸终止反应后，读取吸[[亮度]]（A），绘制曲线如图15-10。读取A值在1.0时的酶标抗体稀释度，作为酶标抗体的工作浓度。该酶标抗人IgG的工作浓度应为1/1600。
2．棋盘[[滴定法]]选择包被抗原工作浓度
（1）用包被液将抗原作一系列稀释后进行包被，洗涤。
（2）将[[强阳]]性参考血清、弱阳性参考血清和阴性参考血清用稀释液作1:100稀释，加样，保温，洗涤。
（3）加按工作浓度稀释的酶标抗人IgG抗体，保温，洗涤。
（4）加底物显色。加酸终止反应后读取A值。
（5）选择强阳性参考血清的A值为0.8左右、阴性参考血清的A值小于0.1的包被抗的的稀释度作为工作浓度。表15-1为本例的测定结果，表中数字为A值。从表中可见1:200为最舒适的工作浓度。
表15-1 间接[[酶联免疫吸附剂测定法]]包被抗原工作浓度的选择
各类血清
1:50
1:100
1:200
1:400
1:800
强阳性
1.20
1.04
0.84
0.68
0.42
弱阳性
0.64
0.41
0.30
0.22
0.19
阴性
0.23
0.13
0.08
0.66
0.05
稀释液
0.09
0.02
0.02
0.02
0.04
（二）夹心法测抗原
在夹心法酶联免疫吸附剂测定法中可用棋盘滴定法同时选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度，举例如下（表15-2）：
表15-2 夹心酶联免疫吸附剂测定包被抗体和酶标抗体工作浓度的选择
强阳性（25ng/ml）
弱阳性（1.5ng/ml）
阴性
10μg/ml
1:1000
1.17
0.15
0.09
1:5000
0.46
0.03
0
1:25000
0.12
0
0
1μg/ml
1:1000
＞2
0.25
0.10
1:5000
0.91
0.12
0.01
1:25000
0.25
0.01
0
0.1μg/ml
1:1000
0.42
0.13
0.13
1:5000
0.11
0.03
0.02
1:25000
0.03
0
0
（1）抗体免疫球蛋白用包被缓冲液稀释至蛋白浓度为10、1和0.1μg/ml，分别在酶联免疫吸附剂测定板上进行包被，每一浓度包括三个纵行，洗涤。
（2）在一个横行各包被孔中加入强阳性抗原液，另一横行加入弱阳性抗原液，第三横行加入阴性对照液，保温，洗涤。
（3）将酶标抗体用稀释液稀释成三个浓度，例如1:1000、1:5000和1:25000。分别加入每一包被浓度的一个纵行中，保温，洗涤。
（4）加底物显色。加酸终止反应后，读取A值。
（5）以强阳性抗原的A值在0.8左右、阴性参考的A值小于0.1的条件作最适条件，据此选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度。从表15-2可看出包被抗体浓度可选用1μg/ml，酶标抗体的稀释度可选为1:5000。为了进一步节省试剂，可以此浓度为基点，缩小间距再做进一步的棋盘[[滴定]]。 测定方法的标准化
要使酶联免疫吸附剂测定测定得到准确的结果，不论是定性的还是定量的，必须严格按照[[规定]]的方法制备试剂和实施测定。主要试剂的制备要点已如前述，其他一般性试剂，如包被缓冲液、洗涤液、标本稀释液、结合物稀释液、底物工作液和酶反应终止液等，配制时不可掉以轻心。缓冲液可于冰箱中[[短期]]保存，使用前应观察是否变质。[[蒸馏水]]的质量在酶联免疫吸附剂测定中也至关重要，最好使用新鲜重蒸馏的。不合格的蒸馏水可使空白值升高。
测定的实施中，应力求各个步骤操作的标准化，下面以板式酶联免疫吸附剂测定为例，介绍有关注意事项。 （一）加样
在酶联免疫吸附剂测定中除了包被外，一般需进行45加样。在定性测定中有时不强调加样量的准确性，例如规定为加样一滴。此时应该使用相同口径的滴管，保持准确的加样[[姿势]]，使每滴液体的体积基本相同。在定量测定中则加样量应力求准确。标本和结合物的稀释液应按规定配制。加样时应将液体加在孔底，避免加在孔壁上部，并注意不可出现气泡。 （二）保温
在酶联免疫吸附剂测定中一般有二次[[抗原抗体反应]]，即加标本后和加结合物后，此时反应的温度和时间应按规定的要求，保温容器最好是水浴箱，可使温度迅速平衡。各酶联免疫吸附剂测定板不应叠在一起。为避免[[蒸发]]，板上应加盖，或将板平放在底部垫有湿纱布的湿盒中。湿盒应该是[[金属]]的，传热容易。如用保温箱，空湿盒应预先放在其中，以平衡温度，这在室温较低时更为重要。加入底物后，反应的时间和温度通常不做严格要求。如室温高于20℃，酶联免疫吸附剂测定板可避光放在实验台上，以便不时观察，待对照管显色适当时，即可终止酶反应。 （三）洗涤
洗涤在酶联免疫吸附剂测定过程中不是反应聚，但却是决定实验成败的关键。洗涤的目的是洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯待塑料对蛋白质的吸附作用是普遍性的。因此在酶联免疫吸附剂测定测定的反应过程中应尽量避免非特异性吸附，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。在标本和结合物的稀释液和洗涤液中加入聚山梨酯（吐温，Tween）一类物质即右达到此目的。聚山梨酯是聚氧[[乙烯]]去水[[山梨醇]][[脂肪酸]]酯，为非[[离子]]型的[[表面张力]]物质，常作为助[[溶剂]]。根据脂肪酸的种类而对聚山梨酯编号，结合[[月桂酸]]的为[[聚山梨酯20]]，在酶联免疫吸附剂测定中最为常用。它的洗涤效果好，并具有减少非特异性吸附和增强抗原抗体结合的作用。
洗涤如不彻底，特别在最后一次，如有酶结合物的非特异性吸附，将使空白值升高。另外，在间接法中如血清标本内的非特异性IgG吸附在固相上而未被洗净，也将与酶标抗体作用而产生干扰。
酶联免疫吸附剂测定板的洗涤一般可采用以下方法：①吸干孔内反应液；②将洗涤液注满板孔；③放置2min，略作摇动；④吸干孔内液，也可倾去液体后在[[吸水]]纸上拍干。洗涤的次数一般为3～4次，有时甚至需洗5～6次。 （四）比色
如阴性对照颜色极浅，在定性测定中一般可采用目视比色。如用比色计测定结果，准确性决定于酶联免疫吸附剂测定板底的平整与透明度和比色计的质量。
== 百科帮你涨知识 ==
[http://www.zk120.com/ji/ 查找更多中医古籍]
[http://www.zk120.com/an/ 查找更多名老中医的医案]
[http://www.zk120.com/fang/ 查找更多方剂]
== 酶联免疫吸附剂测定基本原理==
这一[[方法]]的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相[[载体]]表面，并[[保持]]其[[免疫]]活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起[[反应]]。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检[[物质的量]]成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接[[相关]]，故可根据颜色反应的深浅刊物[[定性]]或[[定量分析]]。由于酶的催化[[频率]]很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的[[敏感]]度。
== 方法类型和操作步骤==
酶联免疫吸附剂测定可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶[[作用]]的底物。根据试剂的来源和标本的[[性状]]以及[[检测]]的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。 （一）双抗体夹心法
双抗体夹心法（图15-4）是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：
图15-4双抗体夹心法测抗原示意图
（1）将[[特异性]]抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。
（2）加受检标本：使之与固相抗体[[接触反应]]一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。
（3）加酶标抗体：使固相[[免疫复合物]]上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。
（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。
根据同样原理，将[[大分]]子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。
（二）双位点一步法
在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原[[分子]]上两个不同[[抗原决定簇]]的[[单克隆抗体]]分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了[[反应时间]]，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的酶联免疫吸附剂测定提高到新水平。
图15-5双位点一步法示意图
在一步法测定中，应[[注意]]钩状[[效应]]（hookeffect），类同于[[沉淀反应]]中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。 （三）间接法测抗体
间[[接法]]（图15-6）是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的[[抗抗体]]以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：
（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。
（2）加稀释的受检[[血清]]：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他[[免疫球蛋白]]及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。
（3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。
（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。
本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。
图15-6间接法测抗体示意图 （四）竞争法
竞争法（图15-7）可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下：
（1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。
（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合[[溶液]]，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。
（3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。
图15-7竞争法测抗原示意图
（五）捕获法测IgM抗体
血清[[中针]]对某些抗原的特异性[[IgM]]常和特异性IgG同时存在，后者会[[干扰]]IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法（图15-8），先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下：
图15-8捕获法测IgM抗体示意图
（1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。
（2）加入稀释的血清标本：保温反应[[后血]]清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。
（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。
（4）加[[入针]]对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。
（5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。 （六）应用亲和素和生物素的酶联免疫吸附剂测定
亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个[[生物素]]分子亲密结合。现在使用更多的是从[[链霉菌]]中提取的链霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又称[[维生素]]H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的[[衍生物]]，生物素－[[羟基]][[琥珀]]亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与[[蛋白质]]、[[糖类]]和酶等多种类型的[[大小]]分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为[[稳定]]。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似[[晶格]]的复合体。因此把亲和素和生物素与ELIS偶联起来，就可大提高酶联免疫吸附剂测定的敏感度。
亲和素－生物素[[系统]]在酶联免疫吸附剂测定中的应用有多种形式，可用于间接[[包被]]，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用[[吸附]]法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规酶联免疫吸附剂测定中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，[[然后]]连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。桥联法ABC-酶联免疫吸附剂测定（avidinbiotincomplex-酶联免疫吸附剂测定）夹心法测抗原的过程见图15-9。
图15-9桥连法ABC-酶联免疫吸附剂测定夹心法测抗原示意图
== 酶联免疫吸附剂测定的技术要点==
酶联免疫吸附剂测定的技术要点包括三个方面：试剂的制备、反应条件的选择和操作的[[标准化]]。 试剂的制备
酶联免疫吸附剂测定的主要试剂为固相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体和与标记酶直接关联的酶反应底物。以下叙述这些试剂的原料和制备方法。 （一）固相载体
可作酶联免疫吸附剂测定中载体的物质很多，最常用的是聚[[苯乙烯]]。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的[[性能]]，抗体或蛋白质抗原吸附其上后保留原来的免疫活性。聚苯乙烯为[[塑料]]，可制成各种形式。在酶联免疫吸附剂测定测定过程中，它作为载体和容器，不参与化学反应。加之它的价格低廉，所以被普遍采用。
酶联免疫吸附剂测定载体的[[形状]]主要有三种：小试管、小珠和微量反应板。小试管的特点是还能兼作反应的容器，最[[后放]]入分光光度计中比色。小珠一般为直径0.6cm的圆球，表面经磨砂处理后吸附[[面积]]大增加。如用特殊的洗涤器，在洗涤过程中使圆珠滚动淋洗，效果更好。最常用的载体为微量反应板，专用于酶联免疫吸附剂测定测定的[[产品]]也称为酶联免疫吸附剂测定板，国际通用的标准板形是8×12的96孔式。为便于作少量标本的检测，有制成8联或12联孔条的，放入座架后，大小与标准酶联免疫吸附剂测定板相同。酶联免疫吸附剂测定板的特点是可以同时进行大量标本的检测，并可在特定的比色计上迅速读出结果。现在已有多种自动化仪器用于微量反应板型的酶联免疫吸附剂测定检测，包括加样、洗涤、保温、比色等步骤，对操作的标准化极为有利。
良好的酶联免疫吸附剂测定板应该是吸附性能好，空白值低，孔底[[透明度]]高，各板之间和同一板各孔之间性能相近。聚苯乙烯酶联免疫吸附剂测定板由于配料的不同和制作工艺的差别，各种产品的质量差异很大。因此每一[[批号]]的聚苯乙烯制品在使用前须[[检查]]其性能。常用的检查方法为：以一定浓度的人IgG（一般为10ng/ml）包被酶联免疫吸附剂测定板各孔后，每孔内加入适当稀释的酶标抗人IgG抗人IgG抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止酶反应后分别测每孔溶液的吸光度。[[控制]]反应条件，使各读数在0.8左右。计算所有读数的平均值。所有单个读数与平均读数之差应小于10％。
与聚苯乙烯类似的塑料为聚[[氯乙烯]]。作为酶联免疫吸附剂测定固相载体，聚氯乙烯板的特点为质软板薄，可切割，价廉、但光洁度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值有时也略高。
为[[比较]]不同固相在某一酶联免疫吸附剂测定测定中的优劣，可用以下方法加以[[检验]]：用其它[[免疫学]]测定方法选出一个典型的阳性标本和一个典型的阴性标本。将它们分别进行一系列稀释后，在不同的固相载体上按预定的酶联免疫吸附剂测定操作步骤进行测定，然后比较测定结果。在哪一种载体上阳性结果与阴性结果判别最大，这种载体就是这一酶联免疫吸附剂测定测定的最合适的固相载体。
除塑料制品外，固相酶免疫测定的载体还有两种材料：一是微孔滤膜，如[[硝酸]][[纤维素]]膜、[[尼龙]]膜等，这类测定形式将在本章第五节“膜载体的酶免疫测定”[[中介]]绍。另一种载体是以含铁的磁性微粒制作的，[[反应时]]固相微粒悬浮在溶液中，具有液[[相反]]应的速率，反应结束后用磁铁吸引作为[[分离]]的手段，洗涤也十分方便，但需配备特殊的仪器。
（二）抗原和抗体
在酶联免疫吸附剂测定实施过程中，抗原和抗体的质量是实验是否成功的关键因素。本法要求所用抗原纯度高，抗体[[效价]]高、亲和力强。
酶联免疫吸附剂测定所用抗原有三个来源：天然抗原、[[重组]]抗原和合成[[多肽]]抗原。天然抗原取材于动物[[组织]]或[[体液]]、[[微生物]]培养物等，一般含有多种抗原成分，需经纯化，提取出特定的抗原成分后才可应用，因此也称提纯抗原（purifiedantigen）。重组抗原（recombinantantigen）和多肽抗原（peptideantigen）均为人工合成品，使用安全，而且纯度高，[[干扰物]]质少。因此虽然制备合成抗原有较高的技术难度且要求较为昂贵的仪器设备和试剂，其应用仍十分普遍，特别是对那些天然抗原不易得到的试验，更显出其独到之处。
用于酶联免疫吸附剂测定的抗体有多[[克隆]]的和单克隆的。[[抗血清]]成分复杂，应从中提取IgG才可用于包被固相或酶标记。含单克隆抗体的小鼠[[腹水]]中的特异性抗体含量较高，有时可适当稀释后直接进行包被。制备酶结合物用的抗体的质量往往要求有较高的纯度。经[[硫酸]]铵[[盐析]]纯化的IgG可进一步用各种分子筛[[层析]]提纯。也可用亲和层析法提纯特异性IgG，如用酶[[消化]]IgG后提取的Fab片段，则效果更好。 （三）免疫吸附剂
固相的抗原或抗体称为免疫吸附剂。将抗原或抗体固相化的过程称为包被（coating）。由于载体的不同，包被的方法也不同。如以聚苯乙烯酶联免疫吸附剂测定板为载体，通常将抗原或抗体溶于[[缓冲液]]（最常用的为pH9.6的碳酸缓冲液）中，加于酶联免疫吸附剂测定板孔中在4℃过夜，经[[清洗]]后即可应用。如果包被液中的蛋白质浓度过低，固相载体表面有能被此蛋白质完全覆盖，其后加入的血清标本和酶结合物中的蛋白质也会部分地吸附于固相载体表面，最后产生非特异性显色而导致本底偏高。在这种情况下，如在包被后再用1％～5％[[牛血]]清[[白蛋白]]包被一次，可以消除这种干扰。这一过程称为封闭（blocking）。包被好的酶联免疫吸附剂测定板在低温可放置一段时间而不失去其免疫活性。
（四）酶和底物
酶联免疫吸附剂测定中所用的酶要求纯度高、催化反应的[[转化率]]高、专一性强、性质稳定、来源丰富、价格不贵、制备成的酶标抗体或[[抗原性]]质稳定，继续保留着它的活性部分和催化[[能力]]。最好在受检标本中不存在与标记酶相同的酶。另外它的相应底物应易于制备和[[保存]]，价格低廉，有色产物易于测定，光[[吸收]]高。酶联免疫吸附剂测定中最常用的酶为[[辣根]]过氧化酶（HRP）和从[[牛肠]]粘膜或[[大肠杆菌]]提取的[[碱性磷酸酶]]（[[AP]]）。
HRP在蔬菜[[作物]]辣根中含量很高，纯化方法也不复杂。它是一种糖蛋白，含糖量约18％；分子量为44kD；是一种[[复合酶]]，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成的一种[[卟啉]]蛋白质。主酶为无色糖蛋白，在275nm波长处有最高吸收峰；辅基是深棕色的含铁卟啉环，在403nm波长处有最高吸收峰。HRP催化下列反应：
上式中DH2为供氢体，H2O2O为受氢体。HRP对受氢体的专一性很高，除H2O2外，仅作用于[[小分]]子醇的[[过氧化物]]和[[尿素]]的过氧化物。后者为固体，作为试剂较H2O2方便。许多[[化合物]]可作为HRP的供氧体，在酶联免疫吸附剂测定中常用的供氢体底物为邻苯二胺（orthopenylenediamine，OPD）、四甲基[[联苯胺]]（3，3＇，5，5＇-tetramethylbenzidine，TMB）和ABTS[2，2＇-azino-bis（3-ethyl-benzthiazolinesulfonate-6）]。
OPD为在酶联免疫吸附剂测定中应用最多的底物，[[灵敏度]]高，比色方便。其缺点是配成应用液后稳定性差，而且具有致异[[变性]]。TMB无此缺点。TMB经酶作用后由无色变蓝色，目测对比鲜明；加酸停止酶反应后变黄色，可在比色计中定量；因此应用日见增多。ABTS，虽然灵敏度不如OPD和TMB，但空白值很低。HRP催化OPD的反应如下：
HRP的纯度用RZ（ReinheitZahl，意为纯度数）表示，是403nm的吸光度与280nm的吸光度之比，高纯度的HRP的RZ≥3.0。应注意的是酶变性后，RZ可不变而活力降低，故重用[[酶制剂]]时更重要的指标为活力。[[酶活力]]以单位表示：1min将1μmol的底物转化为产物的酶量为1个单位。
在酶联免疫吸附剂测定中另一常用的酶为碱性磷酸酶。从大肠杆菌提取的AP分子量为80kD，酶作用的最适pH为8.0；用小牛肠粘膜提取的AP分子量为100kD，最适pH为9.6。一般采用对[[硝基苯]][[磷酸]]酯（p-nitrophenylphosphate，p-NPP）作为底物。它可制成片状试剂，使用方便。产物为黄色的对[[硝基]]酚，在405nm有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一段时间。反应式如下：
在酶联免疫吸附剂测定中应用AP系统，其敏感性一般高于应用HRP系统，空白值也较低。但由于AP较难得到高纯度制剂，稳定性较HRP低，价格较HRP高，制备酶结合物时得率较HRP低等原因，国内在酶联免疫吸附剂测定中一般均采用HRP。
除HRP和AP以外，在商品酶联免疫吸附剂测定试剂中应用的酶尚有[[葡萄糖氧化酶]]、[[β-半乳糖苷酶]]和脲酶等。β-[[半乳糖]]苷酸的底物常用4-甲基伞基-β-D半乳糖苷（4-mehtyumbelliferyl-β-D-galactoside），经酶水解后产生[[荧光]]物质4-甲基伞酮（4-mehtylumbelliferone），可用荧光计检测。荧光的放大作用大大提高了方法的敏感度。AP也可应用可产生荧光的伞基磷酸酯作底物。其缺点是[[需要]]荧光计测定，而且如用固相载体直接作为测定容器，此载体不可发出荧光。脲酶的特点是酶作用后反应液[[发生]]pH改变，可使[[指示剂]]变色；另外，在[[人体]]内没有内源酶（酶的化学发光底物见第十八章）。
（五）结合物
酶标记的抗原或抗体称为结合物（conjugate）。抗原由于化学[[结构]]不同，可用不同的方法与酶结合。如为蛋白质抗原，基本上可参考[[抗体酶]]标记的方法。制备抗体酶结合物的方法通常有以下几种。
1．[[戊二醛]]交联法戊二醛是一种双[[功能]]团试剂，可以使酶与蛋白质或其他抗原的[[氨基]]通过它而偶联。戊二醛交联可用一步法（如连接AP），也可用二步法（如连接HRP）。举例如下：
2～5mg纯抗体与5mgAP混合于0.1mol/LpH6.8的磷酸缓冲液1ml中，4℃下对同上缓冲液[[透析]][[平衡]]。磁力搅拌下，缓慢加入1％戊二醛0.05ml，在室[[温下]]放置2小时。在4℃下对0.05mol/LpH8.0Tris缓冲液透析平衡，即得酶标抗体。
辣根过氧化物酶可[[溶解]]于50％饱和度硫酸铵中。用上法交联后可用50％饱和度硫酸铵沉淀酶标抗体，弃去上清中游离酶。
戊二醛一步法操作简便、有效，而且[[重复性]]好。缺点是交联时分子间的比例不严格，大小也不一，影响效果。
制备HRP抗体结合物也可用二步法，即先将HRP与戊二醛作用，透析除去戊二醛，在pH9.5缓冲液中再与抗体作用而形成酶标抗体。此法的效率可高于一步法10倍左右。
2．过[[碘酸]]盐氧化法本法只用于HRP的交联。该酶含18％[[碳水化合物]]，过碘酸盐将其分子表面的[[多糖]]氧化为[[醛基]]。用[[硼氢化钠]]（NaBH4）中和多余的过碘酸。酶上的醛根很活泼，可与蛋白质结合，形成[[按摩]]尔比例结合的酶标结合物。有人认为此法为辣根过氧化物酶交联最有效的方法。但也有只认为由于所用试剂较为剧烈，各批实验结果不易重复。
按以上方法制备的结合物一般混有未结合的酶和抗体。理论上结合物中混有游离酶不影响酶联免疫吸附剂测定中最后的[[酶活性]]测定，因经过洗涤，非特异性吸附于固相上的游离酶已被洗去。但游离的抗体则会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，因而减低结合到固相上的酶标抗体量。因此制备的结合物应予以纯化。纯化的方法较多，分离大分子[[混合物]]的方法均可应用。硫酸铵[[盐析法]]操作简便，但效果不如用SephadexG-200[[凝胶]][[过滤]]的好。
最适工作浓度的选择
在建立某一酶联免疫吸附剂测定测定中，应对包被抗原或抗体的浓度和酶标抗原或抗体的浓度予以选择，以达到最合适的测定条件和节省测定费用。下面以间接法测抗体和夹心法测抗原为例，介绍最适工作浓度的选择方法。 （一）间接法测抗体
1．酶标抗抗体工作浓度的选择
（1）用100ng/ml人IgG进行包被，洗涤。
（2）将酶标抗人IgG用稀释液作一系列稀释后分别加入已包被的孔中，保温、洗涤。
（3）加底物显色。加酸终止反应后，读取吸[[亮度]]（A），绘制曲线如图15-10。读取A值在1.0时的酶标抗体稀释度，作为酶标抗体的工作浓度。该酶标抗人IgG的工作浓度应为1/1600。
2．棋盘[[滴定法]]选择包被抗原工作浓度
（1）用包被液将抗原作一系列稀释后进行包被，洗涤。
（2）将[[强阳]]性参考血清、弱阳性参考血清和阴性参考血清用稀释液作1:100稀释，加样，保温，洗涤。
（3）加按工作浓度稀释的酶标抗人IgG抗体，保温，洗涤。
（4）加底物显色。加酸终止反应后读取A值。
（5）选择强阳性参考血清的A值为0.8左右、阴性参考血清的A值小于0.1的包被抗的的稀释度作为工作浓度。表15-1为本例的测定结果，表中数字为A值。从表中可见1:200为最舒适的工作浓度。
表15-1 间接[[酶联免疫吸附剂测定法]]包被抗原工作浓度的选择
各类血清
1:50
1:100
1:200
1:400
1:800
强阳性
1.20
1.04
0.84
0.68
0.42
弱阳性
0.64
0.41
0.30
0.22
0.19
阴性
0.23
0.13
0.08
0.66
0.05
稀释液
0.09
0.02
0.02
0.02
0.04
（二）夹心法测抗原
在夹心法酶联免疫吸附剂测定法中可用棋盘滴定法同时选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度，举例如下（表15-2）：
表15-2 夹心酶联免疫吸附剂测定包被抗体和酶标抗体工作浓度的选择
强阳性（25ng/ml）
弱阳性（1.5ng/ml）
阴性
10μg/ml
1:1000
1.17
0.15
0.09
1:5000
0.46
0.03
0
1:25000
0.12
0
0
1μg/ml
1:1000
＞2
0.25
0.10
1:5000
0.91
0.12
0.01
1:25000
0.25
0.01
0
0.1μg/ml
1:1000
0.42
0.13
0.13
1:5000
0.11
0.03
0.02
1:25000
0.03
0
0
（1）抗体免疫球蛋白用包被缓冲液稀释至蛋白浓度为10、1和0.1μg/ml，分别在酶联免疫吸附剂测定板上进行包被，每一浓度包括三个纵行，洗涤。
（2）在一个横行各包被孔中加入强阳性抗原液，另一横行加入弱阳性抗原液，第三横行加入阴性对照液，保温，洗涤。
（3）将酶标抗体用稀释液稀释成三个浓度，例如1:1000、1:5000和1:25000。分别加入每一包被浓度的一个纵行中，保温，洗涤。
（4）加底物显色。加酸终止反应后，读取A值。
（5）以强阳性抗原的A值在0.8左右、阴性参考的A值小于0.1的条件作最适条件，据此选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度。从表15-2可看出包被抗体浓度可选用1μg/ml，酶标抗体的稀释度可选为1:5000。为了进一步节省试剂，可以此浓度为基点，缩小间距再做进一步的棋盘[[滴定]]。 测定方法的标准化
要使酶联免疫吸附剂测定测定得到准确的结果，不论是定性的还是定量的，必须严格按照[[规定]]的方法制备试剂和实施测定。主要试剂的制备要点已如前述，其他一般性试剂，如包被缓冲液、洗涤液、标本稀释液、结合物稀释液、底物工作液和酶反应终止液等，配制时不可掉以轻心。缓冲液可于冰箱中[[短期]]保存，使用前应观察是否变质。[[蒸馏水]]的质量在酶联免疫吸附剂测定中也至关重要，最好使用新鲜重蒸馏的。不合格的蒸馏水可使空白值升高。
测定的实施中，应力求各个步骤操作的标准化，下面以板式酶联免疫吸附剂测定为例，介绍有关注意事项。 （一）加样
在酶联免疫吸附剂测定中除了包被外，一般需进行45加样。在定性测定中有时不强调加样量的准确性，例如规定为加样一滴。此时应该使用相同口径的滴管，保持准确的加样[[姿势]]，使每滴液体的体积基本相同。在定量测定中则加样量应力求准确。标本和结合物的稀释液应按规定配制。加样时应将液体加在孔底，避免加在孔壁上部，并注意不可出现气泡。 （二）保温
在酶联免疫吸附剂测定中一般有二次[[抗原抗体反应]]，即加标本后和加结合物后，此时反应的温度和时间应按规定的要求，保温容器最好是水浴箱，可使温度迅速平衡。各酶联免疫吸附剂测定板不应叠在一起。为避免[[蒸发]]，板上应加盖，或将板平放在底部垫有湿纱布的湿盒中。湿盒应该是[[金属]]的，传热容易。如用保温箱，空湿盒应预先放在其中，以平衡温度，这在室温较低时更为重要。加入底物后，反应的时间和温度通常不做严格要求。如室温高于20℃，酶联免疫吸附剂测定板可避光放在实验台上，以便不时观察，待对照管显色适当时，即可终止酶反应。 （三）洗涤
洗涤在酶联免疫吸附剂测定过程中不是反应聚，但却是决定实验成败的关键。洗涤的目的是洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯待塑料对蛋白质的吸附作用是普遍性的。因此在酶联免疫吸附剂测定测定的反应过程中应尽量避免非特异性吸附，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。在标本和结合物的稀释液和洗涤液中加入聚山梨酯（吐温，Tween）一类物质即右达到此目的。聚山梨酯是聚氧[[乙烯]]去水[[山梨醇]][[脂肪酸]]酯，为非[[离子]]型的[[表面张力]]物质，常作为助[[溶剂]]。根据脂肪酸的种类而对聚山梨酯编号，结合[[月桂酸]]的为[[聚山梨酯20]]，在酶联免疫吸附剂测定中最为常用。它的洗涤效果好，并具有减少非特异性吸附和增强抗原抗体结合的作用。
洗涤如不彻底，特别在最后一次，如有酶结合物的非特异性吸附，将使空白值升高。另外，在间接法中如血清标本内的非特异性IgG吸附在固相上而未被洗净，也将与酶标抗体作用而产生干扰。
酶联免疫吸附剂测定板的洗涤一般可采用以下方法：①吸干孔内反应液；②将洗涤液注满板孔；③放置2min，略作摇动；④吸干孔内液，也可倾去液体后在[[吸水]]纸上拍干。洗涤的次数一般为3～4次，有时甚至需洗5～6次。 （四）比色
如阴性对照颜色极浅，在定性测定中一般可采用目视比色。如用比色计测定结果，准确性决定于酶联免疫吸附剂测定板底的平整与透明度和比色计的质量。
== 百科帮你涨知识 ==
[http://www.zk120.com/ji/ 查找更多中医古籍]
[http://www.zk120.com/an/ 查找更多名老中医的医案]
[http://www.zk120.com/fang/ 查找更多方剂]
