528,223
个编辑
更改
人二倍体细胞株来源于正常人[[胎儿]][[组织]]，主要用于培养[[病毒]]制备[[疫苗]]等。
== 人二倍体细胞建株、检定及制备疫苗规程==
细胞株的要求
用于疫苗生产的人二倍体细胞株（以下简称[[细胞株]]）须按下列[[规定]]进行全面检定。[[新建]]立细胞株，应按《新[[生物制品]]审批办法》进行审批。
1 建立细胞株必须具备下列资料
1.1 建立细胞株所用的胎儿的胎龄和性别，中止[[妊娠]]原因。
1.2 建立细胞株所用胎儿的父、母年龄、职业及健康状况，胎儿父、母系三代应无明显[[遗传]]缺陷和[[肿瘤]]疾病历史。在取胎儿组织时，应作出详细调查，报卫生部审批前，应进行一次重复调查。
1.3 原始组织种类，原代培养的数量与[[生长]]状况。
1.4 [[细胞培养]]史和生长特征，[[细胞]]寿命、[[世代]]数。
1.5 细胞生长液的成分。
2 细胞株的检定
2.1 [[染色体]]的[[鉴定]]和制片
细胞原系建株过程，每8～12世代*应作一次染色体[[检查]]，一株细胞整个[[生命]]期内[[连续培养]]过程中，至少应有4～5次染色体检查结果。
每次染色体检查，应从同一世代不同细胞培养瓶中取细胞混合再培养，制备染色体[[标本]]片。染色体标本应长期[[保存]]（直至褪色不能用为止），以备复查。
每次染色体检查，至少应[[随机]]取1000个分裂[[中期]]细胞，进行染色体数目、[[形态]]和[[结构]]检查，并作出有助于复查的记录，其中至少选择50个分裂中期细胞进行显微[[照相]]，作出[[核型]][[分析]]。并应粗数500个分裂中期细胞，检查[[多倍体]]的[[发生]]率。
可以G分带或Q分带技术检查50个中期细胞染色体[[带型]]，应用照相图片作出带型分析。以显带技术检出的核型异常（假[[二倍体]]、倒位、易位等）发生率应用比现用上限更宽的基本数据进行评价，合格上限尚未定出。
2.1.1 合格要求
1000个和500个[[中医]]细胞标本中，检查异常率、合格的上限（可信限95%，Poison法）如表1。
表1
1000
500
100
[[染色单体]]和染色体断裂
47
26
8
结构异常
17
10
2
超二培性
8
5
2
亚二倍性*
180
90
18
多倍性**
30
17
4
*亚二倍性超过上限时，可选用批标本片重数
**+一个中期细胞内超过53条染色体即为一个多倍体
2.1.2 染色体制片要求
应及时进行制片质量检查，如发现细胞堆积，染色体分散不好等，由于技术原因不适于读片时，可以及时重新制片。但已经读片后，不断因某项超过标准（亚二位性除外）而废弃不算。如考虑到制片技术与质量问题，可重试两次，当有一次结果与原结果相近时，又无可知原因，应以原结果为准。
2.2 [[外源因子]]检查
细胞株不应有[[细菌]]、[[霉菌]]、支原体和病毒等[[污染]]。每8～12世代细胞培养物，应进行下列检查。
2.2.1 细菌、霉菌、支原[[体检]]查
按《[[生物制品无菌试验规程]]》进行。
2.2.2 病毒检查
2.2.2.1 细胞直接观察及[[红细胞]][[吸附]]试验
取混合瓶细胞[[样品]]，接种小瓶或小管，长成单层后更换维持液，观察2周，镜检细胞，应[[保持]]正常形态特征。培养7天，用0.2%～0.5%鸡和豚鼠混合红细胞悬液进行红细胞吸附试验，先置于4～8℃，后置于20～25℃，各30分钟，两次观察结果均应为阴性。
2.2.2.2 细胞培养检查
细胞培养的上[[清液]]混合样品，至少接种4种细胞（原代人肾或猴肾细胞、原代兔肾细胞、人源[[传代]]细胞和另一批人二倍体细胞）。接种的样品量应占维持液的20%以上，于培养5～7[[天和]]14天时，进行红细胞吸附试验（见2.2.2.1项）。培养7天的上清液在同种细胞培养上盲传一代，观察14天，应无细胞病变，红细胞吸附试验应为阴性（在该试验的细胞维持液中，允许加入少量该细胞培养用的[[牛血]]清，以利细胞维持和观察）。
2.2.2.3 动物试验检查
用乳鼠、成鼠、家兔、豚鼠和鸡胚各一组。每组动物或鸡胚接种受检细胞不应少于107。按表2所列要求进行试验和观察。如80%以上动物和鸡胚健存，此试验为通过。
2.2.2.4 其他检查
细胞株传代过程中，至少于2个不同世代水平进行[[包涵体]]、[[乙型肝炎表面抗原]]及电镜检查，结果均应为阴性。
2.3 肿瘤原体检查
每8～12世代做一次细胞株的异种[[移植]]试验，观察细胞株有无致肿瘤性质，每次实验使用6只乳鼠（3～5[[日龄]]）或[[体重]]8～10g小白鼠，经抗[[胸腺]][[血清]]（ATS）处理，皮下接种活二倍体细胞（最适传代的细胞），观察14天，检查有无[[结节]]形成。有结节或可[[疑病]]灶时，做病理[[切片]]检查。试验同时，用HeLa或其他人源[[传代细胞系]]做阳性对照试验，用动物数与处理[[方法]]同试验组，接种被检二倍体细胞数应为对照肿瘤细胞数的5倍以上。结果二倍体细胞株不应有移植瘤形成，而对照组细胞则应有80%或更多的动物有典型移植瘤出现（肿瘤结节需经病理[[组织学]]诊断）。
表2
动物组别
要求
动物或鸡胚数
接种途径
接种细胞悬液量
（ml/只）
观察[[天数]]
结果
乳鼠
24小时内
2窝≥10
脑内
腹腔
0.01
0.1
21
应健存
成鼠
12～14g
10
脑内
腹腔
0.03
0.5
21
应健存
豚鼠
350～500g
5
腹腔
5.0
42
应健存,[[解剖]]无[[结核]]病变
家兔
1.5～2.5kg
5
皮内
皮下
0.1×10**
9.0
21
无异常
健存
鸡胚
9～11日龄
10
[[尿囊]]腔
0.2
3～4
[[尿液]]血凝试验阴性***
*豚鼠于注射前及观察4周作[[旧结核菌素]]试验，应为阴性
**每只于背部皮内注射10处，每处0.1ml
***应用豚鼠和鸡混合红细胞作直接血凝试验
可以用任何以[[免疫抑制剂]]处理，并对肿瘤细胞有同样[[敏感]]性的其他动物试验，如无胸腺小白鼠（nude nu/nu[[基因型]]等）。
3 细胞[[种子]]
细胞株传代过程的早期，应选定[[适应]]世代数培养出大量细胞，制成悬液，分装安瓿作为细胞种子。置液氮中冻存，以备细胞株建成后，大量供应细胞。
冻存的种子细胞活存率应在60%以上。冻存后一定时间，应至少复苏培养一系至[[衰老]]期，并在不同传代水平，检查细胞株的生长、[[胞核学]]特征、异种移植等，证明细胞经冻存后的[[生物学]]性质无明显改变。
二倍体细胞用于疫苗生产的要求
1 细胞
1.1 细胞株
用于疫苗生产的细胞株，必须符合本规程要求。不含外源因子、核型正常、对病毒敏感和具有足够多的细胞种子。可用KMB-17、2BS等细胞株。所用细胞株均须经卫生部批准。
1.2 细胞种子批
一个细胞种子批应有足够量早世代细胞，分装安瓿保存于液氮中，作为细胞种子。
2 生产用细胞种子批
用一个或数个细胞种子安瓿传代增殖到适宜世代，具有一定量的均一细胞悬液，分装安瓿，标明世代、安瓿号和冻存的日期，保存于液氮中，作为生产用细胞种子。
2.1 生产用细胞种子批检定
2.1.1 细菌、霉菌、支原体检查
按《生物制品无菌试验规程》进行。
2.1.2 动物和鸡胚检查外源因子
用生产用细胞种子世代水平或至2/3世代寿命水平的细胞作检定样品。用下列动物和鸡胚检查：
乳鼠（24小时内）
2窝最少
10只
成鼠
12～14g
10只
豚鼠
350～500g
5只
家兔
1.5～2.5kg
5只
鸡胚
9～11日龄
10只
各种动物和鸡胚的接种法、观察期，按照A2.2.2.3条进行。
2.1.3 肿瘤原性检查
按A2.3项执行。
2.1.4 染色体的[[监测]]
检查用于生产的最后一个世代或其后任一世代，至少检查500个中期细胞的多倍性、染色体精确计数、断裂率、结构异常及其他[[异常发生]]率，例如螺旋消失或初级[[次缢痕]]或次级次缢痕的明显减弱等。按A2.1.1项进行评价。
生产用[[细胞库]]细胞染色体监测用的染色体标本片和照片，应作为该细胞批监测此细胞生产疫苗批的记录，永久保存。
3 生产用细胞的培养
3.1 从生产用细胞种子开始[[传代培养]]，以适宜分种率连续传代，直至增殖足够量的细胞培养物用于生产。用于生产的细胞世代，应在细胞整个寿命期的前2/3世代内。
3.2 细胞外源因子检查
于种毒当天，或在连续传代种毒，于最后一次细胞种毒当天，此批细胞留取2%～5%不种毒，换维持液作为正常细胞对照，以检查外源因子。从换液之日起观察2周，细胞应无异常变化。
用换维持液0～2天的对照细胞上清液，接种原代兔肾、非人灵长类传代细胞及另一批人二倍体细胞，接种样品量应占维持液的20%。观察14天，换液后5～8天用上清液，在相应细胞盲代一代，观察14天，做血吸附试验。
在收毒时，用0.2%～0.5%鸡和豚鼠红细胞，在2～8℃和20～25℃做血吸附试验，应为阴性。
3.3 细胞鉴别试验
在生产用细胞世代水平或其后数代，检查300个中期细胞，计数多倍体，作100个中期细胞染色体检查，应核型正常，鉴别确为本细胞无误。
除染色体监测外，还可用[[HLA]]表面[[抗原]]鉴定试验。
──────────────────
*细胞“世代”的说明：英文是“Population doubling”，简写“[[PD]]”，译成“[[群体]]培增”，为通俗和[[习惯]]以名词“世代”来表示。PD可按实际计数，增加一倍，或按细胞培养[[面积]]，增加一倍，为一个PD，即一个世代。也就是细胞以1:2分种率传代则为一个世纪，以1:4分种率传代则为2个世代，1:8分种率传代则为3个世代。
== 百科帮你涨知识 ==
[http://www.zk120.com/ji/ 查找更多中医古籍]
[http://www.zk120.com/an/ 查找更多名老中医的医案]
[http://www.zk120.com/fang/ 查找更多方剂]
== 人二倍体细胞建株、检定及制备疫苗规程==
细胞株的要求
用于疫苗生产的人二倍体细胞株（以下简称[[细胞株]]）须按下列[[规定]]进行全面检定。[[新建]]立细胞株，应按《新[[生物制品]]审批办法》进行审批。
1 建立细胞株必须具备下列资料
1.1 建立细胞株所用的胎儿的胎龄和性别，中止[[妊娠]]原因。
1.2 建立细胞株所用胎儿的父、母年龄、职业及健康状况，胎儿父、母系三代应无明显[[遗传]]缺陷和[[肿瘤]]疾病历史。在取胎儿组织时，应作出详细调查，报卫生部审批前，应进行一次重复调查。
1.3 原始组织种类，原代培养的数量与[[生长]]状况。
1.4 [[细胞培养]]史和生长特征，[[细胞]]寿命、[[世代]]数。
1.5 细胞生长液的成分。
2 细胞株的检定
2.1 [[染色体]]的[[鉴定]]和制片
细胞原系建株过程，每8～12世代*应作一次染色体[[检查]]，一株细胞整个[[生命]]期内[[连续培养]]过程中，至少应有4～5次染色体检查结果。
每次染色体检查，应从同一世代不同细胞培养瓶中取细胞混合再培养，制备染色体[[标本]]片。染色体标本应长期[[保存]]（直至褪色不能用为止），以备复查。
每次染色体检查，至少应[[随机]]取1000个分裂[[中期]]细胞，进行染色体数目、[[形态]]和[[结构]]检查，并作出有助于复查的记录，其中至少选择50个分裂中期细胞进行显微[[照相]]，作出[[核型]][[分析]]。并应粗数500个分裂中期细胞，检查[[多倍体]]的[[发生]]率。
可以G分带或Q分带技术检查50个中期细胞染色体[[带型]]，应用照相图片作出带型分析。以显带技术检出的核型异常（假[[二倍体]]、倒位、易位等）发生率应用比现用上限更宽的基本数据进行评价，合格上限尚未定出。
2.1.1 合格要求
1000个和500个[[中医]]细胞标本中，检查异常率、合格的上限（可信限95%，Poison法）如表1。
表1
1000
500
100
[[染色单体]]和染色体断裂
47
26
8
结构异常
17
10
2
超二培性
8
5
2
亚二倍性*
180
90
18
多倍性**
30
17
4
*亚二倍性超过上限时，可选用批标本片重数
**+一个中期细胞内超过53条染色体即为一个多倍体
2.1.2 染色体制片要求
应及时进行制片质量检查，如发现细胞堆积，染色体分散不好等，由于技术原因不适于读片时，可以及时重新制片。但已经读片后，不断因某项超过标准（亚二位性除外）而废弃不算。如考虑到制片技术与质量问题，可重试两次，当有一次结果与原结果相近时，又无可知原因，应以原结果为准。
2.2 [[外源因子]]检查
细胞株不应有[[细菌]]、[[霉菌]]、支原体和病毒等[[污染]]。每8～12世代细胞培养物，应进行下列检查。
2.2.1 细菌、霉菌、支原[[体检]]查
按《[[生物制品无菌试验规程]]》进行。
2.2.2 病毒检查
2.2.2.1 细胞直接观察及[[红细胞]][[吸附]]试验
取混合瓶细胞[[样品]]，接种小瓶或小管，长成单层后更换维持液，观察2周，镜检细胞，应[[保持]]正常形态特征。培养7天，用0.2%～0.5%鸡和豚鼠混合红细胞悬液进行红细胞吸附试验，先置于4～8℃，后置于20～25℃，各30分钟，两次观察结果均应为阴性。
2.2.2.2 细胞培养检查
细胞培养的上[[清液]]混合样品，至少接种4种细胞（原代人肾或猴肾细胞、原代兔肾细胞、人源[[传代]]细胞和另一批人二倍体细胞）。接种的样品量应占维持液的20%以上，于培养5～7[[天和]]14天时，进行红细胞吸附试验（见2.2.2.1项）。培养7天的上清液在同种细胞培养上盲传一代，观察14天，应无细胞病变，红细胞吸附试验应为阴性（在该试验的细胞维持液中，允许加入少量该细胞培养用的[[牛血]]清，以利细胞维持和观察）。
2.2.2.3 动物试验检查
用乳鼠、成鼠、家兔、豚鼠和鸡胚各一组。每组动物或鸡胚接种受检细胞不应少于107。按表2所列要求进行试验和观察。如80%以上动物和鸡胚健存，此试验为通过。
2.2.2.4 其他检查
细胞株传代过程中，至少于2个不同世代水平进行[[包涵体]]、[[乙型肝炎表面抗原]]及电镜检查，结果均应为阴性。
2.3 肿瘤原体检查
每8～12世代做一次细胞株的异种[[移植]]试验，观察细胞株有无致肿瘤性质，每次实验使用6只乳鼠（3～5[[日龄]]）或[[体重]]8～10g小白鼠，经抗[[胸腺]][[血清]]（ATS）处理，皮下接种活二倍体细胞（最适传代的细胞），观察14天，检查有无[[结节]]形成。有结节或可[[疑病]]灶时，做病理[[切片]]检查。试验同时，用HeLa或其他人源[[传代细胞系]]做阳性对照试验，用动物数与处理[[方法]]同试验组，接种被检二倍体细胞数应为对照肿瘤细胞数的5倍以上。结果二倍体细胞株不应有移植瘤形成，而对照组细胞则应有80%或更多的动物有典型移植瘤出现（肿瘤结节需经病理[[组织学]]诊断）。
表2
动物组别
要求
动物或鸡胚数
接种途径
接种细胞悬液量
（ml/只）
观察[[天数]]
结果
乳鼠
24小时内
2窝≥10
脑内
腹腔
0.01
0.1
21
应健存
成鼠
12～14g
10
脑内
腹腔
0.03
0.5
21
应健存
豚鼠
350～500g
5
腹腔
5.0
42
应健存,[[解剖]]无[[结核]]病变
家兔
1.5～2.5kg
5
皮内
皮下
0.1×10**
9.0
21
无异常
健存
鸡胚
9～11日龄
10
[[尿囊]]腔
0.2
3～4
[[尿液]]血凝试验阴性***
*豚鼠于注射前及观察4周作[[旧结核菌素]]试验，应为阴性
**每只于背部皮内注射10处，每处0.1ml
***应用豚鼠和鸡混合红细胞作直接血凝试验
可以用任何以[[免疫抑制剂]]处理，并对肿瘤细胞有同样[[敏感]]性的其他动物试验，如无胸腺小白鼠（nude nu/nu[[基因型]]等）。
3 细胞[[种子]]
细胞株传代过程的早期，应选定[[适应]]世代数培养出大量细胞，制成悬液，分装安瓿作为细胞种子。置液氮中冻存，以备细胞株建成后，大量供应细胞。
冻存的种子细胞活存率应在60%以上。冻存后一定时间，应至少复苏培养一系至[[衰老]]期，并在不同传代水平，检查细胞株的生长、[[胞核学]]特征、异种移植等，证明细胞经冻存后的[[生物学]]性质无明显改变。
二倍体细胞用于疫苗生产的要求
1 细胞
1.1 细胞株
用于疫苗生产的细胞株，必须符合本规程要求。不含外源因子、核型正常、对病毒敏感和具有足够多的细胞种子。可用KMB-17、2BS等细胞株。所用细胞株均须经卫生部批准。
1.2 细胞种子批
一个细胞种子批应有足够量早世代细胞，分装安瓿保存于液氮中，作为细胞种子。
2 生产用细胞种子批
用一个或数个细胞种子安瓿传代增殖到适宜世代，具有一定量的均一细胞悬液，分装安瓿，标明世代、安瓿号和冻存的日期，保存于液氮中，作为生产用细胞种子。
2.1 生产用细胞种子批检定
2.1.1 细菌、霉菌、支原体检查
按《生物制品无菌试验规程》进行。
2.1.2 动物和鸡胚检查外源因子
用生产用细胞种子世代水平或至2/3世代寿命水平的细胞作检定样品。用下列动物和鸡胚检查：
乳鼠（24小时内）
2窝最少
10只
成鼠
12～14g
10只
豚鼠
350～500g
5只
家兔
1.5～2.5kg
5只
鸡胚
9～11日龄
10只
各种动物和鸡胚的接种法、观察期，按照A2.2.2.3条进行。
2.1.3 肿瘤原性检查
按A2.3项执行。
2.1.4 染色体的[[监测]]
检查用于生产的最后一个世代或其后任一世代，至少检查500个中期细胞的多倍性、染色体精确计数、断裂率、结构异常及其他[[异常发生]]率，例如螺旋消失或初级[[次缢痕]]或次级次缢痕的明显减弱等。按A2.1.1项进行评价。
生产用[[细胞库]]细胞染色体监测用的染色体标本片和照片，应作为该细胞批监测此细胞生产疫苗批的记录，永久保存。
3 生产用细胞的培养
3.1 从生产用细胞种子开始[[传代培养]]，以适宜分种率连续传代，直至增殖足够量的细胞培养物用于生产。用于生产的细胞世代，应在细胞整个寿命期的前2/3世代内。
3.2 细胞外源因子检查
于种毒当天，或在连续传代种毒，于最后一次细胞种毒当天，此批细胞留取2%～5%不种毒，换维持液作为正常细胞对照，以检查外源因子。从换液之日起观察2周，细胞应无异常变化。
用换维持液0～2天的对照细胞上清液，接种原代兔肾、非人灵长类传代细胞及另一批人二倍体细胞，接种样品量应占维持液的20%。观察14天，换液后5～8天用上清液，在相应细胞盲代一代，观察14天，做血吸附试验。
在收毒时，用0.2%～0.5%鸡和豚鼠红细胞，在2～8℃和20～25℃做血吸附试验，应为阴性。
3.3 细胞鉴别试验
在生产用细胞世代水平或其后数代，检查300个中期细胞，计数多倍体，作100个中期细胞染色体检查，应核型正常，鉴别确为本细胞无误。
除染色体监测外，还可用[[HLA]]表面[[抗原]]鉴定试验。
──────────────────
*细胞“世代”的说明：英文是“Population doubling”，简写“[[PD]]”，译成“[[群体]]培增”，为通俗和[[习惯]]以名词“世代”来表示。PD可按实际计数，增加一倍，或按细胞培养[[面积]]，增加一倍，为一个PD，即一个世代。也就是细胞以1:2分种率传代则为一个世纪，以1:4分种率传代则为2个世代，1:8分种率传代则为3个世代。
== 百科帮你涨知识 ==
[http://www.zk120.com/ji/ 查找更多中医古籍]
[http://www.zk120.com/an/ 查找更多名老中医的医案]
[http://www.zk120.com/fang/ 查找更多方剂]
