目录

更改

跳转至: 导航搜索

组织多肽抗原

添加11,918字节, 2017年3月6日 (一) 15:08
创建页面,内容为“== 检查名称== 组织多肽抗原 == 英文名称== Tissue Polypeptide Antigen.TPA == 分类== 血清检查/肿瘤免疫检测 == 化验取...”
== 检查名称==

组织多肽抗原

== 英文名称==

Tissue Polypeptide Antigen.TPA
== 分类==

[[血清]]学[[检查]]/[[肿瘤免疫]][[检测]]
== 化验取材==

[[血液]]
== 概述==

组织多肽抗原(tissue polypeptide antigen,TPA)是一种[[胎儿]][[抗原]],见于增殖旺盛的[[组织]]。正常组织中含量甚微。TPA被[[细胞]][[角蛋白]]8、18和19的[[抗体]]所识别。已[[分离]]出具有TPA[[免疫]][[反应]]的不同[[蛋白质]],[[分子]]量为20~45kD)。TPA与某些细胞分裂素、[[细胞骨架]]蛋白有广泛的共源性,当细胞分裂时,其浓度增高。TPA是一种普通的[[肿瘤]]标记,无[[器官]][[特异性]]。
== 原理==

本法是标记抗原(Ag·)和非标记抗原(Ag)对特异性抗体(Ab)的竞争[[抑制]]反应,其反应为Ag·+Ag+Ab(Ag·Ab)+(AgAb)。当Ag·和Ab的量[[保持]]恒定,Ag与Ag·之和大于Ab上的有效结合点的数目,在该条件下,Ag与Ag·间存在着函数关系,亦即随着Ag浓度增加,Ag-Ab生成量多,而Ag·-Ab的数量则减少,游离的Ag·就增多。因为Ag·对Ab的结合,可因Ag竞争结合而遭抑制。反之,当Ag量少时,Ag-Ab生成量就少,Ag·-Ab量增多,而游离的Ag·减少(图1)。将结合的抗原抗体复合物(B)与游离抗原(F)分离,分别测定B和F的放射活性,计算出B/F或B/B+F值,可制出B/F或B/B+p对Ag量的关系曲线图。测定时,需用一系列已知浓度的Ag和一定量Ag·及相应抗体Ab混合,[[然后]]测出各标准浓度Ag参加下的Ag·-Ab放射结合率(B/B+F)或(B/F),绘出竞争抑制标准曲线(图2)。试验时,在同样条件下,根据被测Ag的放射性结合率,从标准曲线上查知相应Ag含量。

== 试剂==

(1)抗原的纯化:试验需用高纯度的抗原。通常,蛋白质抗原的纯度应达到[[电泳]][[分析]]纯,电泳后仅显示单一区带,并具有足够或完整的[[免疫原性]]。一般先经聚[[丙烯酰胺]]电泳[[鉴定]],再用等电聚焦[[SDS]]聚丙烯酰胺[[双相]]电泳鉴定为单一区带,然后用于[[免疫动物]]和[[核素]]标记。

纯抗原因其[[溶液]]中缺乏其他蛋白质作[[稳定剂]],或因贮存在纯[[离子]]浓度的[[缓冲液]]中,故易形成聚合物,因此在纯化抗原时需加[[注意]]。若采用聚合物抗原的标记,用于[[RIA]]中将会显著增加非特异性结合,降低测定的[[灵敏度]]。

(2)抗原的标记[[方法]]:标记用的核素有γ射线和β射线两大类。前者常用131I、125I、51[[Cr]],后者多用3H、32P和14C。选择放射性核素首先要考虑比放射性,比放射性愈高,参与反应的抗原化学量就愈小,[[测定方法]]的灵敏度相对就愈高。核放射性和[[半衰期]]要适宜,便于使用和防护。标记后的抗原要保持其免疫原性。标记技术要简便、经济。

标记方法有直接标记和间接标记两大类,以最常用的125I为例分述如下。

①直接标记:将125I直接结合于蛋白质侧链残基的[[酪氨酸]]上,步骤单一,操作简便,标记物的比放射性较高,但此法仅能用于标记含酪氨酸的[[化合物]],如所含的酪氨酸残基为蛋白质的特异性和生物活性所必需,则该活性易因标记而失活。

最常用的直接标记法为氯胺T标记法(简称h-T):氯胺T是对[[甲基苯]][[磺基]]酰胺的N氯[[衍生物]]的钠盐,在水溶液中[[分解]]形成次氯酸成为一种[[氧化剂]]。在偏碱溶液中([[pH值]]7.5)能使带负电荷的125I离子([[Na]]-125I)氧化成带正电荷的125I离子,借以取代蛋白质酪氨酸[[苯环]]的氢,形成二碘酪氨酸。

125I标记率的高低与抗原(蛋白质或[[多肽]])分子中酪氨酸的含量及其在分子中的暴露程度有关。

标记方法的原则是将纯化抗原和125I加入小试管底部,继将配制的氯胺T快速冲入,混匀振荡1~2min后加入偏重[[亚硫酸]]钠终止反应。再加[[碘化钾]]溶液稀释,然后在[[葡聚糖]]G50柱上分离,分别用井型闪烁计数器测定放射性强度([[脉冲]]数/min、cpm),前部为标记抗原峰,后部为游离125I峰。在标记抗原峰试管中加等量1%[[白蛋白]]作为稳定剂即为标记抗原液。

②间接标记:是先将125I标记在[[载体]]上,纯化后再与蛋白质或肽抗原结合,用N[[琥珀]]酰亚胺-3-[4-羟5-(125I)碘苯][[丙酸]]盐(NSHPP)作为间接标记试剂,该试剂的N琥珀酰亚胺基与多肽游离[[氨基]]缩合为结合物,使125I标记的苯基与蛋白质的氨基结合。

本法先以氯胺T使125I接上NSHPP,由于在水溶液中它迅速水解为3-(4-羟苯基)丙酸,故在碘化反应中要尽快减少这种水解[[作用]]。这种碘标记物必须从水箱抽提到有机溶液中去,再除去[[有机溶剂]]后,使125I-NSHPP与蛋白质结合,制成125I-NSHPP-蛋白质标记物。

本法可标记缺乏酪氨酸残基的多肽,其最大优点是不[[损伤]]蛋白质的活性,能[[保存]]标记物高度的[[酶活性]]或免疫活性,适合于对不[[稳定]]的蛋白质标记,缺点是操作复杂,标记率低。

(3)标记抗原的鉴定:为保证放射免疫测定的质量,制备的标记物必需作如下鉴定:

游离放射性碘的含量 用[[三氯乙酸]]将所有蛋白质沉淀,分别测定沉淀物和上[[清液]]的cpm值。一般要求游离碘占总放射性碘的5%以下。标记抗原贮存过久时,可出现标记物的解离,一旦超过5%则应废弃。

免疫活性 用小量标记抗原加过量抗体,反应后分离B和F,分别测定其放射性,算出百分结合率,此值应在80%以上,值越大,表示损伤抗原越少。

放射强度 它是指单位重量抗原的放射强度,比放射性越高,测定越[[敏感]]。标记抗原的比放射性以125I的标记率或利用率表示。

(4)抗体的制备和鉴定 RIA中所用的抗体应具有高亲和力和高特异性,制备高价单相[[抗血清]],最好以标记用的纯化抗原免疫动物,制备[[半抗原]]的抗血清,需先将半抗原与载体结合,使成[[免疫原]],常用的载体为[[牛血]]清白蛋白。

抗血清同样也要加以严格鉴定,包括其灵敏度、亲和力和特异性。在固定量标记抗原与不同浓度的抗血清作用的条件下,测定B/F值,制得一条B/F值对不同稀释度抗血清的曲线图(图3),该曲线的直线部分上段的斜率是抗体最大亲和力的[[定性]]标志,也是灵敏度的标志。斜率越大,RIA灵敏度越高,在许多RIA反应[[系统]]中,呈最大灵敏度的抗体浓度为B/F=1。

当采用固定量的抗体(Q0)与不同浓度的抗原作用时,以B/F对B作图,所得曲线的斜率就是亲和[[常数]](Ka)的负数(图4)。

在RIA反应系统中,测定[[结构]][[相似]]的不同物质时,可以鉴定抗体的特异性。

== 操作方法==

本法分三个步骤,即抗原与抗体反应、B和F分离和放射性测定。

(1)抗原与抗体反应:将[[标本]](非标记抗原)、标记抗原和抗血清顺序定量加入小试管内,置室温(15~30℃)作用24h,使其充分竞争结合。

(2)B、F分离:分离技术多种多样,常用沉淀法。①第二抗体沉淀法:又称双抗体法,在受检抗原与第一抗体特异性反应后加入相应的第二抗体,使形成的抗原-第一抗体-第二抗体的复合物共沉,一经离心即可使结合标记抗原B与游离抗原F分离。本法是特异性沉淀,分离完全,非特异性结合力低。但第二抗体用量较大,成本较高。此外血清浓度、抗凝剂的有无因素可在一定程度上影响结果。②[[聚乙二醇]]([[PEG]])沉淀法:使蛋白质处于等电点状态,水化层破坏而导致蛋白质沉淀。本法优点是PEG制备方便、价廉、分离快速,缺点是非特异沉淀物较多,分离不完全。③第二抗体-聚乙二醇沉淀法:本法既有PEG法的快速沉淀优点,且保持第二抗体特异性沉淀的作用,又减少第二抗体用量,并降低PEG浓度,使非特异沉淀物减少。④[[活性炭]][[吸附]]法:利用活性炭表面活性将[[小分]]子的游离部分吸附。如在活性炭表面涂上一层葡聚糖,使它表面具有一定孔径的网眼,从而允许小分[[子游]]离抗原或半抗原逸入而被吸附,而[[大分]]子复合物则被排斥在外。在抗原与抗体反应后,加入葡聚糖-活性炭,放置5~10min,使游离抗原吸附在活性炭颗粒上,离心使颗粒沉淀,上清液中含有结合的标记抗原。

(3)放射性强度测定:B和F分离后,即可测定其放射性强度。[[测量]]仪器有两类:液体闪烁计数仪(测β射线)和[[晶体]]闪烁计数仪(测γ射线)。计数单位是探测器输出的电脉冲数,单位为cpm(脉冲数/min)。

每次测定均需作一标准曲线图,以标准抗原的不同浓度为横坐标,以测到的相应放射性强度为纵坐标作图。放射性强度可任选B或F,亦可采用计算值B/B+F、B/F或B/B0。标本应作双份测定,取其平均值,在标准曲线上查出相应的受检抗原浓度。

== 正常值==

<60U/L。
== 临床意义==

TPA的分子量17,000~43,000,由[[B1]]、B2和C叁个亚基组成,其活性主要在B1。TPA主要存在于[[胎盘]]和大部分肿瘤组织中,各种[[恶性肿瘤]]([[卵巢癌]]、[[结肠癌]]、[[直肠癌]]、肝细胞癌、[[胰腺癌]]、[[肺癌]]、[[乳腺癌]]、[[子宫内膜癌]]、[[睾丸肿瘤]]等)[[患者]]血清TPA的检出率(以>130U/L血清为阳性)可从20%至90%,有人认为高达80%~100%,它的存在与肿瘤[[发生]]部位、组织类型均无[[相关]]性。

正常人阳性率4.7%。但有相当一部分非恶性肿瘤患者血清中有TPA存在,其阳性率约为14%~35%,以下呼吸道、肝及[[尿路感染]]者多见,故TPA亦非肿瘤所特有的标志。但在恶性肿瘤者中,TPA的增高往往是持续性的,因此,若进行连续[[监测]],常常有利于恶性肿瘤与非恶[[性病]]变的鉴别。

TPA作为一项肿瘤标志尚有以下临床意义:肿瘤患者术前TPA增高非常显着者,常提示预后不良;经治疗病情好转后,TPA量再次增高,提示有肿瘤复发;与CEA同时检测可明显提高乳腺癌诊断的正确性,有腹于恶性与非恶性乳腺病变之间的鉴别诊断。

(1)肺癌患者血清TPA水平明显增高,TPA水平与临床分期及[[淋巴结]][[转移]]呈正相关,手术后显著下降,复发早期即有明显上升。提示检测血清TPA对肺癌的病情监测及复发的早期诊断具有一定的临床意义。
(2)血清TPA增高还可见于[[胃癌]]、乳腺癌、[[前列腺癌]]、[[膀胱癌]]、卵巢癌及[[胆管癌]]等恶性肿瘤,如配合其他[[肿瘤标志物]]检查.可早期发现上述肿瘤的复发。

(3)在某些非肿瘤性疾病如[[肺气肿]]、[[支气管]]炎、良性[[肝病]]、[[消化性溃疡]]、[[胰腺炎]]以及[[妊娠]]时,血清TPA亦可增高,但其增高幅度不如恶性肿瘤。

(4)TPA可用于胆管癌[[和肝]]细胞癌的鉴别,在胆管癌时TPA为阳性,而肝细胞癌时则为阴性。
== 附注==

术前组织多肽抗原显著升高提示预后不良。恶性肿瘤患者经治疗好转后,若组织多肽抗原再次升高提示肿瘤复发。

== 百科帮你涨知识 ==

[http://www.zk120.com/ji/ 查找更多中医古籍]

[http://www.zk120.com/an/ 查找更多名老中医的医案]

[http://www.zk120.com/fang/ 查找更多方剂]
528,223
个编辑

导航菜单