组织多肽抗原
检查名称
组织多肽抗原
英文名称
Tissue Polypeptide Antigen.TPA
分类
化验取材
概述
组织多肽抗原（tissue polypeptide antigen，TPA）是一种胎儿抗原，见于增殖旺盛的组织。正常组织中含量甚微。TPA被细胞角蛋白8、18和19的抗体所识别。已分离出具有TPA免疫反应的不同蛋白质，分子量为20～45kD）。TPA与某些细胞分裂素、细胞骨架蛋白有广泛的共源性，当细胞分裂时，其浓度增高。TPA是一种普通的肿瘤标记，无器官特异性。
原理
本法是标记抗原（Ag·）和非标记抗原（Ag）对特异性抗体（Ab）的竞争抑制反应，其反应为Ag·＋Ag＋Ab（Ag·Ab）＋（AgAb）。当Ag·和Ab的量保持恒定，Ag与Ag·之和大于Ab上的有效结合点的数目，在该条件下，Ag与Ag·间存在着函数关系，亦即随着Ag浓度增加，Ag-Ab生成量多，而Ag·-Ab的数量则减少，游离的Ag·就增多。因为Ag·对Ab的结合，可因Ag竞争结合而遭抑制。反之，当Ag量少时，Ag-Ab生成量就少，Ag·-Ab量增多，而游离的Ag·减少（图1）。将结合的抗原抗体复合物（B）与游离抗原（F）分离，分别测定B和F的放射活性，计算出B/F或B/B＋F值，可制出B/F或B/B＋p对Ag量的关系曲线图。测定时，需用一系列已知浓度的Ag和一定量Ag·及相应抗体Ab混合，然后测出各标准浓度Ag参加下的Ag·-Ab放射结合率（B/B＋F）或（B/F），绘出竞争抑制标准曲线（图2）。试验时，在同样条件下，根据被测Ag的放射性结合率，从标准曲线上查知相应Ag含量。
试剂
（1）抗原的纯化：试验需用高纯度的抗原。通常，蛋白质抗原的纯度应达到电泳分析纯，电泳后仅显示单一区带，并具有足够或完整的免疫原性。一般先经聚丙烯酰胺电泳鉴定，再用等电聚焦SDS聚丙烯酰胺双相电泳鉴定为单一区带，然后用于免疫动物和核素标记。
纯抗原因其溶液中缺乏其他蛋白质作稳定剂，或因贮存在纯离子浓度的缓冲液中，故易形成聚合物，因此在纯化抗原时需加注意。若采用聚合物抗原的标记，用于RIA中将会显著增加非特异性结合，降低测定的灵敏度。
（2）抗原的标记方法：标记用的核素有γ射线和β射线两大类。前者常用131I、125I、51Cr,后者多用3H、32P和14C。选择放射性核素首先要考虑比放射性，比放射性愈高，参与反应的抗原化学量就愈小，测定方法的灵敏度相对就愈高。核放射性和半衰期要适宜，便于使用和防护。标记后的抗原要保持其免疫原性。标记技术要简便、经济。
标记方法有直接标记和间接标记两大类，以最常用的125I为例分述如下。
①直接标记：将125I直接结合于蛋白质侧链残基的酪氨酸上，步骤单一，操作简便，标记物的比放射性较高，但此法仅能用于标记含酪氨酸的化合物，如所含的酪氨酸残基为蛋白质的特异性和生物活性所必需，则该活性易因标记而失活。
最常用的直接标记法为氯胺T标记法（简称h-T）：氯胺T是对甲基苯磺基酰胺的N氯衍生物的钠盐，在水溶液中分解形成次氯酸成为一种氧化剂。在偏碱溶液中（pH值7.5）能使带负电荷的125I离子（Na-125I）氧化成带正电荷的125I离子，借以取代蛋白质酪氨酸苯环的氢，形成二碘酪氨酸。
125I标记率的高低与抗原（蛋白质或多肽）分子中酪氨酸的含量及其在分子中的暴露程度有关。
标记方法的原则是将纯化抗原和125I加入小试管底部，继将配制的氯胺T快速冲入，混匀振荡1～2min后加入偏重亚硫酸钠终止反应。再加碘化钾溶液稀释，然后在葡聚糖G50柱上分离，分别用井型闪烁计数器测定放射性强度（脉冲数/min、cpm），前部为标记抗原峰，后部为游离125I峰。在标记抗原峰试管中加等量1%白蛋白作为稳定剂即为标记抗原液。
②间接标记：是先将125I标记在载体上，纯化后再与蛋白质或肽抗原结合，用N琥珀酰亚胺-3-[4-羟5-（125I）碘苯]丙酸盐（NSHPP）作为间接标记试剂，该试剂的N琥珀酰亚胺基与多肽游离氨基缩合为结合物，使125I标记的苯基与蛋白质的氨基结合。
本法先以氯胺T使125I接上NSHPP，由于在水溶液中它迅速水解为3-（4-羟苯基）丙酸，故在碘化反应中要尽快减少这种水解作用。这种碘标记物必须从水箱抽提到有机溶液中去，再除去有机溶剂后，使125I-NSHPP与蛋白质结合，制成125I-NSHPP-蛋白质标记物。
本法可标记缺乏酪氨酸残基的多肽，其最大优点是不损伤蛋白质的活性，能保存标记物高度的酶活性或免疫活性，适合于对不稳定的蛋白质标记，缺点是操作复杂，标记率低。
（3）标记抗原的鉴定：为保证放射免疫测定的质量，制备的标记物必需作如下鉴定：
游离放射性碘的含量 用三氯乙酸将所有蛋白质沉淀，分别测定沉淀物和上清液的cpm值。一般要求游离碘占总放射性碘的5%以下。标记抗原贮存过久时，可出现标记物的解离，一旦超过5%则应废弃。
免疫活性 用小量标记抗原加过量抗体，反应后分离B和F，分别测定其放射性，算出百分结合率，此值应在80%以上，值越大，表示损伤抗原越少。
放射强度 它是指单位重量抗原的放射强度，比放射性越高，测定越敏感。标记抗原的比放射性以125I的标记率或利用率表示。
（4）抗体的制备和鉴定 RIA中所用的抗体应具有高亲和力和高特异性，制备高价单相抗血清，最好以标记用的纯化抗原免疫动物，制备半抗原的抗血清，需先将半抗原与载体结合，使成免疫原，常用的载体为牛血清白蛋白。
抗血清同样也要加以严格鉴定，包括其灵敏度、亲和力和特异性。在固定量标记抗原与不同浓度的抗血清作用的条件下，测定B/F值，制得一条B/F值对不同稀释度抗血清的曲线图（图3），该曲线的直线部分上段的斜率是抗体最大亲和力的定性标志，也是灵敏度的标志。斜率越大，RIA灵敏度越高，在许多RIA反应系统中，呈最大灵敏度的抗体浓度为B/F＝1。
当采用固定量的抗体（Q0）与不同浓度的抗原作用时，以B／F对B作图，所得曲线的斜率就是亲和常数（Ka）的负数（图4）。
在RIA反应系统中，测定结构相似的不同物质时，可以鉴定抗体的特异性。
操作方法
本法分三个步骤，即抗原与抗体反应、B和F分离和放射性测定。
（1）抗原与抗体反应：将标本（非标记抗原）、标记抗原和抗血清顺序定量加入小试管内，置室温（15～30℃）作用24h，使其充分竞争结合。
（2）B、F分离：分离技术多种多样，常用沉淀法。①第二抗体沉淀法：又称双抗体法，在受检抗原与第一抗体特异性反应后加入相应的第二抗体，使形成的抗原-第一抗体-第二抗体的复合物共沉，一经离心即可使结合标记抗原B与游离抗原F分离。本法是特异性沉淀，分离完全，非特异性结合力低。但第二抗体用量较大，成本较高。此外血清浓度、抗凝剂的有无因素可在一定程度上影响结果。②聚乙二醇（PEG）沉淀法：使蛋白质处于等电点状态，水化层破坏而导致蛋白质沉淀。本法优点是PEG制备方便、价廉、分离快速，缺点是非特异沉淀物较多，分离不完全。③第二抗体-聚乙二醇沉淀法：本法既有PEG法的快速沉淀优点，且保持第二抗体特异性沉淀的作用，又减少第二抗体用量，并降低PEG浓度，使非特异沉淀物减少。④活性炭吸附法：利用活性炭表面活性将小分子的游离部分吸附。如在活性炭表面涂上一层葡聚糖，使它表面具有一定孔径的网眼，从而允许小分子游离抗原或半抗原逸入而被吸附，而大分子复合物则被排斥在外。在抗原与抗体反应后，加入葡聚糖-活性炭，放置5～10min，使游离抗原吸附在活性炭颗粒上，离心使颗粒沉淀，上清液中含有结合的标记抗原。
（3）放射性强度测定：B和F分离后，即可测定其放射性强度。测量仪器有两类：液体闪烁计数仪（测β射线）和晶体闪烁计数仪（测γ射线）。计数单位是探测器输出的电脉冲数，单位为cpm（脉冲数/min）。
每次测定均需作一标准曲线图，以标准抗原的不同浓度为横坐标，以测到的相应放射性强度为纵坐标作图。放射性强度可任选B或F，亦可采用计算值B/B＋F、B/F或B/B0。标本应作双份测定，取其平均值，在标准曲线上查出相应的受检抗原浓度。
正常值
＜60U/L。
临床意义
TPA的分子量17,000～43,000，由B1、B2和C叁个亚基组成，其活性主要在B1。TPA主要存在于胎盘和大部分肿瘤组织中，各种恶性肿瘤（卵巢癌、结肠癌、直肠癌、肝细胞癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、睾丸肿瘤等）患者血清TPA的检出率（以>130U/L血清为阳性）可从20%至90%，有人认为高达80%～100%，它的存在与肿瘤发生部位、组织类型均无相关性。
正常人阳性率4.7%。但有相当一部分非恶性肿瘤患者血清中有TPA存在，其阳性率约为14%～35%，以下呼吸道、肝及尿路感染者多见，故TPA亦非肿瘤所特有的标志。但在恶性肿瘤者中，TPA的增高往往是持续性的，因此，若进行连续监测，常常有利于恶性肿瘤与非恶性病变的鉴别。
TPA作为一项肿瘤标志尚有以下临床意义：肿瘤患者术前TPA增高非常显着者，常提示预后不良；经治疗病情好转后，TPA量再次增高，提示有肿瘤复发；与CEA同时检测可明显提高乳腺癌诊断的正确性，有腹于恶性与非恶性乳腺病变之间的鉴别诊断。
（1）肺癌患者血清TPA水平明显增高，TPA水平与临床分期及淋巴结转移呈正相关，手术后显著下降，复发早期即有明显上升。提示检测血清TPA对肺癌的病情监测及复发的早期诊断具有一定的临床意义。
（2）血清TPA增高还可见于胃癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌及胆管癌等恶性肿瘤，如配合其他肿瘤标志物检查．可早期发现上述肿瘤的复发。
（3）在某些非肿瘤性疾病如肺气肿、支气管炎、良性肝病、消化性溃疡、胰腺炎以及妊娠时，血清TPA亦可增高，但其增高幅度不如恶性肿瘤。
（4）TPA可用于胆管癌和肝细胞癌的鉴别，在胆管癌时TPA为阳性，而肝细胞癌时则为阴性。
附注
术前组织多肽抗原显著升高提示预后不良。恶性肿瘤患者经治疗好转后，若组织多肽抗原再次升高提示肿瘤复发。
