核苷酸酶（nucleotidase）是指水解核苷酸的糖和磷酸间的键而生成无机磷酸和核苷的特异的磷酸酯酶。5′-核苷酸酶（EC3．1．3．5）可作用于腺苷（次黄苷）-5′-磷酸，而对3′-磷酸则无作用。含于前列腺、精液、脑、网膜、蛇毒、马铃薯、酵母和大肠杆菌中。除大肠杆菌的胞周腔（periplasmic space）中存在这种酶可作为典型例子以外，在高等动物细胞中，通常也是与膜结构相结合而存在。3′-核苷酸酶（EC3．1．3．6）可以水解腺苷-3′-磷酸等，存在于麦芽、马铃薯和枯草杆菌中。
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