2010年版药典三部附录Ⅷ
目录
附录Ⅷ A 免疫印迹法
本法系以供试品与特异性抗体结合后，抗体再与酶标抗体特异性结合，通过酶学反应的显色，对供试品的抗原特异性进行检查。
试剂
（1）TG缓冲液 称取三羟甲基氨基甲烷15.12g与甘氨酸72g，加水溶解并稀释至500ml。4℃保存。
（2）EBM缓冲液 量取TG缓冲液20ml、甲醇40ml，加水稀释至200ml。4℃保存。
（3）TTBS缓冲液 称取三羟甲基氨基甲烷6.05g与氯化钠4.5g，量取聚山梨酯80 0.55ml，加适量水溶解，用盐酸调pH值至7.5，加水稀释至500ml。4℃保存。
（4）底物缓冲液 称取3,3'-二氨基联苯胺盐酸盐15mg，加甲醇5ml与30%过氧化氢15μl，加TTBS缓冲液25ml使溶解，即得。临用现配。
检查法
照SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（2010年版药典三部附录Ⅳ C），供试品与阳性对照品上样量应大于100ng。取出凝胶，切去凝胶边缘，浸于EBM缓冲液中30分钟。另取与凝胶同样大小的厚滤纸6张、硝酸纤维素膜1张，用EBM缓冲液浸透。用半干胶转移仪进行转移：在电极板上依次放上湿滤纸3张、硝酸纤维素膜1张、电泳凝胶、湿滤纸3张，盖上电极板，按0.8mA/cm2硝酸纤维素膜恒电流转移45分钟。
取出硝酸纤维素膜浸入封闭液（10%新生牛血清的TTBS缓冲液，或其他适宜封闭液）封闭60分钟。弃去液体，加入TTBS缓冲液10ml，摇动加入适量的供试品抗体（参考抗体使用说明书的稀释度稀释），室温过夜。硝酸纤维素膜用TTBS缓冲液淋洗1次，再用TTBS缓冲液浸洗3次，每次8分钟。弃去液体，再加入TTBS缓冲液10ml，摇动加入适量的生物素标记的第二抗体，室温放置40分钟。硝酸纤维素膜用TTBS缓冲液淋洗1次，再用TTBS缓冲液浸洗3次，每次8汾钟。弃去液体，更换TTBS缓冲液10ml，摇动，加入适量的亲和素溶液和生物素标记的辣根过氧化物酶溶液，室温放置60分钟。硝酸纤维素膜用TTBS缓冲液淋洗1次，再用TTBS缓冲液浸洗4次，每次8分钟。弃去液体，加入适量底物缓冲液，置于室温避光条件下显色，显色程度适当时水洗终止反应。
结果判定
阳性结果应呈现明显色带。阴性结果不显色。
附录Ⅷ B 免疫斑点法
本法系以供试品与特异性抗体结合后，抗体再与酶标抗体特异性结合，通过酶学反应的显色，对供试品的抗原特异性进行检查。
试剂
（1） TG缓冲液 精密称取三羟甲基氨基甲烷15.12g与甘氨酸72g，加水溶解并稀释至500ml。4℃保存。
（2） EBM缓冲掖 量取TG缓冲液20ml、甲醇40ml，加水稀释至200ml。4℃保存。
（3） TTBS缓冲液 称取三羟甲基氨基甲烷6.05g、氯化钠4.5g，吸取聚山梨酯80 0.55ml，加适量水溶解，用盐酸调pH值至7.5，加水稀释至500ml。4℃保存。
（4）底物缓冲液 称取3,3'-二氨基联苯胺盐酸盐（DAB）15mg，取甲醇5ml、30%过氧化氢15μl，溶于25ml TTBS缓冲液中。用前配制。
检查法
取硝酸纤维素膜，用EBM缓冲液浸泡15分钟，将供试品、阴性对照品（可用等量的人白蛋白）及阳性对照品点在膜上，上样量应大于10ng。室温干燥60分钟。取出硝酸纤维素膜，浸入封闭液（10%新生牛血清的TTBS缓冲液，或其他适宜的封闭液）封闭60分钟。弃去液体，加入TTBS缓冲液10ml，摇动加入适量的供试品抗体（参考抗体使用说明书的稀释度稀释），室温过夜。硝酸纤维素膜用TTBS缓冲液淋洗1次，再用TTBS缓冲液浸洗3次，每次8分钟。弃去液体，更换TTBS缓冲液10ml，摇动加入适量的生物素标记的第二抗体，室温放置40分钟。硝酸纤维素膜用TTBS缓冲液淋洗1次，再用TTBS缓冲液浸洗3次，每次8分钟。弃去液体，更换TTBS缓冲液10ml，摇动加入适量的亲和素溶液和生物素标记的辣根过氧化物酶溶液，室温放置60分钟。硝酸纤维素膜用TTBS缓冲液淋洗1次，再用TTBS缓冲液浸洗4次，每次8分钟。弃去液体，加入适量底物缓冲液置于室温避光条件下显色，显色程度适当时水洗终止反应。
结果判定
阳性结果应呈现明显色带。阴性结果不显色。
附录Ⅷ C 免疫双扩散法
本法系在琼脂糖凝胶板上按一定距离打数个小孔，在相邻的两孔内分别加入抗原与抗体，若抗原、抗体互相对应，浓度、比例适当，则一定时间后，在抗原与抗体孔之间形成免疫复合物的沉淀线，以此对供试品的特异性进行检查。
供试品溶液的制备
试剂
（1）0.5%氨基黑染色剂 称取氨基黑10B0.5g，加甲醇50ml、冰醋酸10ml与水40ml的混合液，溶解，即得。
（2）脱色液 量取乙醇45ml、冰醋酸5ml与水50ml混合均匀，即得。
检查法
将完全溶胀的1.5%琼脂糖溶液倾倒于水平玻板上（每平方厘米加0.19ml琼脂糖），凝固后，按下图打孔，直径3mm，孔距3mm（方阵型）。根据需要确定方阵型图数量。中央孔加入抗血清，周边孔加入供试品溶液，并留1孔加入相应阳性对照血清。每孔加样20μl，然后置水平湿盒中，37℃水平扩散24小时。用生理氯化钠溶液充分浸泡琼脂糖凝胶板，以除去未结合蛋白质。将浸泡好的琼脂糖凝胶板放入0.5%氨基黑溶液中染色。用脱色液脱色至背景无色，沉淀线呈清晰蓝色为止。用适当方法保存或复制图谱。
图 方阵型
结果判定
各阳性对照出现相应的沉淀线则试验成立，供试品与人血清（血浆）抗体之间应出现相应沉淀线，表示两者具有同源性。
附录Ⅷ D 免疫电泳法
本法系将供试品通过电泳分离成区带的各抗原，然后与相应的抗体进行双相免疫扩散，当两者比例合适时形成可见的沉淀弧。将沉淀弧与已知标准抗原、抗体生成的沉淀弧的位置和形状进行比较，即可分析供试品中的成分及其性质。
试剂
（1）巴比妥缓冲液（pH8.6） 称取巴比妥4.14g与巴比妥钠23.18g，加适量水，加热使溶解，冷却至室温，再加叠氮钠0.15g，加水使溶解成1500ml。
（2）0.5%氨基黑染液 称取氨基黑10B 0.5g．加甲醇50ml、冰醋酸10ml与水40ml的混合液，溶解。
（3）1.5%琼脂糖溶液 称取琼脂糖1.5g，加水50ml与巴比妥缓冲液50ml，加热使溶胀完全。
（4）脱色液 量取乙醇45ml、冰醋酸5ml与水50ml，混合均匀。
（5）溴酚蓝指示液 称取溴酚蓝50mg，加水使溶解成100ml。
对照品
正常人血清或其他适宜的对照品。
供试品溶液的制备
用生理氯化钠溶液将供试品蛋白质浓度稀释成0.5%。
检查法
将1.5%琼脂糖溶液倾倒于大小适宜的水平玻板上，厚度约3mm，静置，待凝胶凝固成无气泡的均匀薄层后，于琼脂糖凝胶板负极1/3处的上下各打1孔，孔径3mm，孔距10～15mm。测定孔加供试品溶液10μl和溴酚蓝指示液1滴，对照孔加正常人血清或人血浆10μl和溴酚蓝指示液1滴。用3层滤纸搭桥和巴比妥缓冲液（电泳缓冲液）接触，100V恒压电泳约2小时（指示剂迁移到前沿）。电泳结束后，在两孔之间距离两端约3～5mm处挖宽3mm槽，向槽中加入血清抗体或人血浆抗体，槽满但不溢出。放湿盒中37℃扩散24小时。扩散完毕后，用生理氯化钠溶液充分浸泡琼脂糖凝胶板，以除去未结合蛋白质。将浸泡好的琼脂糖凝胶板放入0.5%氨基黑溶液染色，再用脱色液脱色至背景基本无色。用适当方法保存或复制图谱。与对照品比较，供试品的主要沉淀线应为待测蛋白质。
注意事项
（1）电泳时应有冷却系统，否则琼脂糖凝胶会出现干裂。
（2）用生理氯化钠溶液浸泡应充分，否则背景不清晰。
附录Ⅷ E 肽图检查法
本法系通过蛋白酶或化学物质裂解蛋白质后，采用适宜的分析方法鉴定蛋白质一级结构的完整性和准确性。
第一法 胰蛋白酶裂解－反相高效液相色谱法
照高效液相色谱法（2010年版药典三部附录Ⅲ B）测定。
色谱条件
以蛋白质与多肽分析用辛烷基硅烷键合硅胶或十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；柱温为30℃±5℃，对照品与供试品保存温度为2～8℃；以0.1%三氟乙酸的水溶液为流动相A液，以0.1%三氟乙酸的乙腈溶液为流动相B液，流速为每分钟1ml，梯度洗脱70分钟（A液从100%～30%，B液从0～70%），检测波长为214nm。
检查法
取供试品溶液及对照品溶液（均为每1ml中含1mg的溶液，如供试品和对照品浓度不够，则应浓缩至相应的浓度），分别用1%碳酸氢铵溶液充分透析，按1：50 （mg/mg）加入胰蛋白酶溶液[取甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮处理过的（或序列分析纯）胰蛋白酶适量，加1%碳酸氢铵溶液溶解，制成每1ml中含0.1mg的溶液]到供试品溶液与对照品溶液中，于37℃保温16～24小时后，按1: 10加入50%醋酸溶液，以每分钟10000转离心5分钟（或用0.45μm滤膜滤过），精密量取上清液100μl，分别注入液相色谱仪，梯度洗脱，记录色谱图。将供试品溶液的图谱与对照品溶液的图谱进行比较，即得。
第二法 溴化氰裂解法
检查法 取供试品与对照品适量（约相当于蛋白质50μg），用水透析16小时，冷冻干燥，加溴化氰裂解液（称取溴化氰0.3g，加甲酸（70→100）1ml使溶解]20μl溶解，室温放置24小时，裂解物加水180μl，再冷冻干燥。冻干的裂解物用水复溶至适当浓度．照SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（附录Ⅳ C）（胶浓度20%）进行电泳，用银染法染色。
将供试品图谱与对照品图谱进行比较，即得。
附录Ⅷ G A群脑膜炎球菌多糖分子大小测定法
第一法 测磷法（仲裁法）
本法用于测定细菌荚膜多糖在色谱柱中的分配系数（KD）和多糖在规定KD值以前的回收率。
试剂
（1）流动相 称取氯化钠11.7g、叠氮钠0.1g，加水使溶解成1000ml，混匀，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调pH值至7.0。
（2）蓝色葡聚糖2000溶液 称取蓝色葡聚糖200020mg，加流动相使溶解成10ml。
（3）维生素B12溶液 称取10mg维生素B12，加流动相使溶解成10ml。
色谱柱的制备
取琼脂糖4B凝胶或琼脂糖CL-4B凝胶约200ml，加流动相400ml充分搅拌，放置约1小时使其沉淀，倾去上层含悬浮颗粒的悬液。如此反复3～5次后，加流动相200ml，混匀，抽去凝胶中的空气，装于1.5cm×90cm色谱柱中，约87cm高，用流动相洗脱，流速为每小时15～20ml，以2～3倍柱床体积的流动相洗脱（约500ml），使柱床平衡。
色谱柱的标定
取蓝色葡聚糖2000溶液1ml，加至已平衡的色谱柱中，以流动相洗脱，流速每小时15～20ml，用组分收集器收集洗脱液，每管收集3～5ml，照紫外－可见分光光度法（附录Ⅱ A），在波长260nm处测定各管洗脱液的吸光度，以吸光度为纵坐标，洗脱液体积（ml）为横坐标分别作图，波长260nm处的峰顶洗脱液体积为空流体积VO。
量取维生素B12溶液1ml，自“加至已平衡的色谱柱中”起，同法操作，370nm波长处的峰顶洗脱液体积为柱床体积Vi。
测定法
取供试品约1ml（含多糖抗原3～5mg．如为冻干制品可用流动相溶解），加至已标定的色谱柱中，用流动相洗脱，用组分收集器收集洗脱液，每管收集5ml，照磷测定法（2010年版药典三部附录Ⅶ A）测定每管洗脱液的磷含量。以供试品每管洗脱液的磷含量为纵坐标，洗脱液体积（ml）为横坐标作图，主峰峰顶洗脱液体积为Ve。
按下式计算：
式中 KD为供试品分配系数；
Ve为供试品洗脱液体积，ml;
VO为空流体积，ml；
Vi为柱床体积，ml。
计算供试品在KD值<0.5的多糖回收率：
式中RX为KD值<0.5供试品的多糖回收率，%；
AX为供试品在KD值<0.5各管洗脱液的磷含量之和；
A为供试品所有管洗脱液的磷含量之和。
第二法 仪器法
试剂与色谱柱的制备同第一法。
色谱柱的标定
量取蓝色葡聚糖2000溶液1ml与维生素B12溶液0.2ml；混匀后加至已平衡的色谱柱中，以流动相洗脱，流速每小时15～20ml，检测波长206nm，用组分收集器收集洗脱液，记录色谱图，色谱图中，第一峰为篮色葡聚糖2000峰，峰顶的洗脱液体积为空流体积VO；第二峰为维生素B12峰，峰顶的洗脱液体积为柱床体积Vi。
测定法
取供试品约1ml（含多糖抗原3～5mg，如为冻干制品可用流动相溶解），加至已标定的色谱柱中，用流动相洗脱，流速为每小时15～20ml，检测波长206nm，用组分收集器收集洗脱液，记录色谱图，即得。按下式计算：
式中 KD为供试品分配系数；
Ve为供试品洗脱液体积，ml；
VO为空流体积，ml;
Vi为柱床体积，ml。
计算供试品在KD值<0.5的多糖回收率：
式中RX为KD值<0.5供试品的多糖回收率，%；
AX为供试品在KD值<0.5的色谱图面积；
At为供试品色谱图总面积。
【附注】
过柱操作在10～20℃进行。
附录Ⅷ H 伤寒Vi多糖分子大小测定法
本法用于测定细菌荚膜多糖在色谱柱中的分配系数（KD）和多糖在规定KD值以前的回收率。
试剂、色谱柱的制备与色谱柱标定
同附录Ⅷ G 第二法。
测定法
取供试品约1ml（含多糖抗原3～5mg），加至已标定的色谱柱中，用流动相洗脱，流速为每小时15～20ml，用组分收集器收集洗脱液，每管3～5ml。照O-乙酰基测定法（2010年版药典三部附录Ⅵ F），测定每管洗脱液中O-乙酰基的含量，求出O-乙酰基含量最高时的洗脱体积，即为多糖主峰峰顶洗脱体积Ve。
按下式计算：
式中KD为供试品分配系数；
Ve为供试品洗脱液体积，ml；
VO为空流体积，ml；
Vi为柱床体积，ml。
计算供试品在KD值≤0.25的多糖回收率：
式中RX为KD值≤0.25供试品的多糖回收率，%；
AX为供试品在KD值≤0.25各管洗脱液等体积合并液的O-乙酰基含量；
At为供试品所有管洗脱液等体积合并液的O-乙酰基含量。
【附注】
过柱操作在10～20℃进行。
附录Ⅷ I 牛血清白蛋白残留量测定法
本法系采用酶联免疫法测定供试品中残余牛血清白蛋白含量。
供试品溶液的制备
供试品如为冻干剂型，检测前应按标示量复溶后混匀，室温静置30分钟，检测前应再次混匀。供试品如为液体剂型可直接用于检测。
干扰试验
首次采用该法检测的供试品应进行干扰试验。
制备溶液Ⅰ（供试品倍比稀释）、溶液Ⅱ（供试品和30ng/ml的内控标准品等量混合）和溶液Ⅲ（30ng/ml的内控标准品倍比稀释）。当供试品溶液BSA含量高于试剂盒测定范围中点时，则2倍稀释后制备溶液Ⅰ和溶液Ⅱ。溶液Ⅰ、溶液Ⅱ可倍比稀释测定，溶液Ⅲ应多孔测定（至少10孔以上），并在试验间均匀添加。按测定法操作，分别测定溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的BSA含量，溶液Ⅰ与溶液Ⅱ的含量之差应在溶液Ⅲ含量测定值的95%可信区间内，表明供试品不会对该检测法产生干扰作用。
测定法
按试剂盒说明书进行，并采用试剂盒提供的供试品稀释液稀释供试品，供试品应至少进行2个稀释度测定，每个稀释度做双孔平行测定。试剂盒标准品的吸光度、内控参考品测定值、标准品线性相关系数、双孔测定吸光度均应在试剂盒要求范围内，试验有效。以标准品溶液的浓度对其相应的吸光度作直线回归，将供试品的吸光度代入直线回归方程，再乘以稀释倍数，计算出供试品中BSA含量。
【附注】
（1）当同一供试品的低稀释度吸光度明显低于高稀释度吸光度时，可能存在HOOK效应或操作失误，需重试或调整稀释倍数进行检测。
（2）测定BSA含量的容器具应专用，防止实验室中BSA污染。
附录Ⅷ J b型流感嗜血杆菌结合疫苗多糖含量测定法
本法系依据可溶性糖经无机酸处理脱水产生糖醛（戊糖）或糖醛衍生物，生成物能与酚类化合物缩合生成有色物质，以此测定多糖的含量。
试剂
（1）0.1%三氯化铁盐酸溶液 准确称取三氯化铁（FeCl3·6H2O）0.1g，放入清洁的试剂瓶内，加盐酸100ml，待溶解后置2～8℃冰箱保存。
（2）地衣酚（3,5-二羟基甲苯）乙醇溶液 称取地衣酚1g，放入10ml量瓶中，加95%乙醇至10ml。临用前配制。
（3） 25μg/ml核糖对照品溶液 称取D-核糖1.25mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度。
测定法
量取1ml水，加入5ml 0.1%三氯化铁盐酸溶液，混匀后再加入0.4ml地衣酚乙醇溶液，混匀。水浴5分钟后置冰浴，在波长670nm处测定吸光度，作为空白对照。
先将供试品用水稀释至核糖含量不高于25μg/ml，作为供试品溶液，量取1.0ml自“加入5ml 0.1%三氯化铁盐酸溶液”起，同法操作。
分别取核糖对照品溶液0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml于10ml试管中，每管依次加水0.9ml、0.8ml、0.6ml、0.4ml、0.2ml、0ml，自“加入5ml 0.1%三氯化铁盐酸溶液”起，同法操作。
结果计算
以核糖对照品溶液的浓度对其相应的吸光度作直线回归，求得直线回归方程。将供试品溶液的吸光度代入直线回归方程，求出供试品溶液的核糖含量。
供试品多糖含量（μg/ml）=a×n/0.41
式中a为供试品溶液的核糖含量，μg/ml;
n为供试品稀释倍数。
附录Ⅷ K 己二酰肼含量测定法
本法系依据在四硼酸钠存在的条件下，己二酰肼（ADH）中的氨基基团能与三硝基苯磺酸（TNBS）发生显色反应，采用紫外－可见分光光度法测定b型流感嗜血杆菌多糖衍生物中己二酰肼的含量。
试剂
（1）己二酰肼对照品贮备液（1mg/ml） 精密称定己二酰肼0.100g，加水定容至100ml，于-20℃保存。
（2）己二酰肼对照品工作液（20μg/ml） 精密量取ADH对照品贮备液0.2ml，加水定容至10ml。
（3）5%四硼酸钠溶液 称取四硼酸钠（Na2B4O7·10H2O） 47.35g，加水定容至500ml，于室温保存。
（4） 3% TNBS溶液 量取TNBS 5ml，加水定容至50ml，于-20℃保存。
测定法
量取5%四硼酸钠溶液1.0ml，加水1ml，混匀，再加入3% TNBS溶液0.3ml，混匀，于室温放置15分钟，在波长500nm处测定吸光度，作为空白对照。先将供试品用水稀释至己二酰肼浓度不高于20μg/ml，作为供试品溶液，然后取1.0ml，加入5%四硼酸钠溶液1.0ml，自“加入3% TNBS溶液0.3ml”起同法操作。
分别取己二酰肼对照品工作液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml于试管中，每管依次加水0.8ml、0.6ml、0.4ml、0.2ml、0ml，加入5%四硼酸钠溶液1.0ml，自“加入3% TNBS溶液0.3ml”起同法操作。结果计算 以己二酰肼对照品工作液的浓度对其相应的吸光度作直线回归，求得直线回归方程，将供试品溶液的吸光度代入直线回归方程，求出供试品溶液的己二酰肼含量，根据稀释倍数计算供试品的己二酰肼含量。
附录Ⅷ L 高分子结合物含量测定法
本法系利用高分子结合物、低分子结合物及游离多糖在不同乙醇浓度下，沉淀分离，采用紫外－可见分光光度法测定磷含量，计算高分子结合物的含量。
试剂
（1） 5mol/L氯化钠溶液 精密称定氯化钠29.22g，加水溶解并稀释至100ml，室温保存。
（2） 1.5mol/L硫酸 于1体积98%的硫酸中加入11体积的水，混匀。
（3） 2.5%钼酸铵 称取钼酸铵2.65g，加水溶解并稀释至100ml。
（4）10%抗坏血酸 称取抗坏血酸10g，加水溶解并稀释至100ml。
（5）矿化试剂 硫酸与70%高氯酸等体积混合制得。
（6）产色试剂 水、1.5mol/L硫酸、2.5%钼酸铵、10%抗坏血酸，按2:1:1:1体积比混合配制。
（7）80μg/ml磷对照品贮备液 精密称定经100℃干燥的磷酸氢二钠0.3665g或磷酸二氢钾0.3509g，加水500ml、5mol/L硫酸溶液10ml溶解，补加水至1000ml。临用时，将贮备液做20倍稀释，即为4μg/ml磷对照品工作液。
（8）1.0mol/L氢氧化钠溶液 称取4g氢氧化钠，加水溶解并稀释至100ml。
供试品溶液的制备
（1）分步沉淀 原液用生理氯化钠溶液稀释至多糖含量20～28μg/ml或成品疫苗3ml，加入5mol/L氯化钠溶液0.75ml，混匀后加入无水乙醇15ml，于-20℃冰箱放置72～96小时，以每分钟8000转4℃离心90分钟，吸取上清液为供试品溶液2；于沉淀中加入50%乙醇溶液0.5ml，加玻璃珠，混合后室温放置1小时；再加入50%乙醇溶液1.5ml，混合后室温放置2小时，然后以每分钟8000转8℃离心l小时，吸取1.8ml上清液为供试品溶液3；沉淀再加入1.0mol/L氢氧化钠溶液0.5ml，混合后室温放置1小时，加水1.25ml，作为供试品溶液4。
（2）取多糖含量20～28μg/ml的原液或成品疫苗1.0ml为供试品1。
（3）供试品溶液的矿化 分别量取1.0ml供试品1、1.5ml供试品溶液2、0.7ml供试品溶液3、0.5ml供试品溶液4各2份；分别加入矿化试剂0.15ml，置150℃干燥1小时，然后升温至180℃干燥30分钟，再升温至250℃干燥1小时。
测定法
量取水1.95ml，加矿化试剂50μl后加2.0ml产色试剂，混匀后置37℃水浴2小时，在波长825nm处测定吸光度，作为空白对照。
于矿化好的供试品溶液中加水1.85ml，加产色试剂2.0ml，混匀后置37℃水浴2小时，在波长825nm处测定吸光度。
分别量取磷对照品工作液0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml、1.0ml于试管中，每管依次加水1.85ml、1.75ml、1.55ml、1.15ml、0.95ml；然后每管分别加入矿化试剂50μl后加2.0ml产色试剂，混匀后置37℃水浴2小时，在波长825nm处测吸光度。
结果计算
以磷对照品溶液的浓度对其相应的吸光度作直线回归，求得直线回归方程。将供试品溶液的吸光度代入直线回归方程，求出磷含量。
供试品磷含量（μg/ml）分别为：
P1= （A1×3）/1.0
P2-（A2×18. 75）/1.5
P3= （A3×2.0）/0.7
P4= （A4×2.0）/0.5-（P3×10）/100
试验有效性 80%≤P1/（P2+P3+P4）≤120%
供试品高分子结合物含量（%）=P4/（P2+P3+P4）×100
供试品游离多糖含量（%）=[1-P4/（P2+P3+P4）]×100
式中 P1、P2、P3、P4为供试品1，供试品溶液2，供试品溶液3，供试品溶液4的磷含量；A1、A2、A3、A4为供试品1，供试品2，供试品3，供试品4中取样矿化后的磷含量。
