流感病毒抗体
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概述
流行性感冒病毒（influenza virus）分为甲、乙、丙3个型，甲型流感病毒可引起世界性大流行。流感病毒为分节段的单股负链RNA病毒，与核酸结合在一起的蛋白质为核蛋白（nucleoproteiN,NP），NP抗原稳定，具有型特异性。病毒核心外面是与病毒包膜紧密结合的基质蛋白（M蛋白），最外面是病毒的包膜，包膜上有两种刺，一种为血凝素（hemagglutinin，HA），一种为神经氨酸酶（neuraminidase，NA），两者均易变异。
临床上流感病毒的实验室诊断可用血清学方法查抗体，也可用快速方法直接查抗原。查抗体的血清学方法有血凝抑制试验、补体结合试验、中和试验和ELISA等，但用的最多的是血凝抑制试验。查抗原的快速方法有直接和间接免疫荧光法、放射免疫法、ELISA法、免疫电镜法等，但用的最多的是间接免疫荧光法和ELISA法。此外，亦可用PCR法和核酸杂交法查核酸。
流感病毒抗体的医学检查
检查名称
流感病毒抗体
分类
血清学检查 > 病毒的血清学检查
化验取材
流感病毒抗体的测定原理
酶联免疫吸附试验（ELISA）：以感染及未感染合胞病毒的细胞培养分别制备合胞病毒抗原及细胞对照抗原，分别包被于聚苯乙烯板上制成固相抗原，加入待检血清后，血清中如含有抗合胞病毒抗体，则可结合于包被的合胞病毒抗体（而对照抗原则不能结合），形成抗原-抗体复合物，再加入酶标记的抗人IgG（即抗抗体），则形成抗原-抗体-酶标记抗抗体复合物，当加入相应酶的底物，在酶的催化作用下使原来无色的底物水解，氧化，还原呈现颜色反应。通过观察颜色反应的强弱来了解抗体的存在及其滴度。
试剂
（1）在8×12或4×10孔塑料上长成片的狗肾传代细胞（MDCK）
（3）洗涤液：上述稀释液中加0.5g/L Tween20。
（4）pH5.0基质液
（5）底物液10ml pH5.0的基质液加4mg邻苯二胺加30%双氧水（H2O2）5μl，充分混匀（必须使用前新配）。
（6）终止液：4mol/L HCl或H2SO4。
（8）流感病毒株特异的免疫血清或小白鼠混合的单克隆抗体，当然也可用鸡免疫血清。国外常用型特异的小鼠抗血清。
（9）辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌A蛋白（SPA）或辣根过氧化物酶标记的马抗小鼠的IgG抗血清。这些可购买于生物试剂商店。而抗鸡血清IgG需自己制备和标记。
（10）鉴定标本：用pH7.4的Hank液或199或Eagle液或灭菌的生理盐水（后者很少用），让流感样患者含嗽咽部后收回；当前人群中流行的甲、乙型流感病毒（阳性对照）。
操作方法
（1）鉴定血清工作浓度的滴定：成片的MDCK细胞，如它是培养在4×10孔的板中，倒掉培养液，用Hank液洗1～2次，第1和2排接种10－1的甲型流感病毒（当前流行株），第3和4排接种10－1的乙型流感病毒（当前流行株）。其维持液可用199或Eagle氏液，但不含小牛血清而含终浓1μg/ml的胰酶，35℃ CO2孵箱培育过夜，取出，倒掉维持液，每孔加入0.1m 180%丙酮，量4℃ 30min（固定细胞），倒掉丙酮，用稀释液洗1遍，第1，3排和第2，4排，第1～9孔分别加入0.1ml不同稀释度（一般1/200～1/51200）的甲型和乙型抗血清。4排的第10孔均加0.1ml稀释液（病毒对照）。其余步骤同下面（4～7步骤）。用肉眼观察，能显示颜色并其强度明显高于病毒和阴性血清孔的血清最高稀释度的倒数，如1/12000，使用浓度为两倍量即1/6400。
（2）标本接种：取标本上清3ml，按每ml加青霉素1000u，链霉素1000μg，混匀置4℃ 2h后方可接种细胞。
成片的MDCK细胞，长在塑料板孔中或细胞管中均可（无CO2孵箱的单位，可用细胞管，一管相等于一个孔，其余操作均一样），用Hank液洗1～2次，每份标本种12个孔，每孔0.1ml，10－1稀释度的甲、乙型流感病毒按同法各种4个孔，另4孔为细胞对照仅加0.1ml维持液（不管接种标本有多少份细胞对照2～4个孔已足够），置35℃ CO2孵箱吸附1h，倒掉接种液，用Hank氏液洗1遍接着同步骤1；每孔加入0.1ml维持液，35℃ CO2孵箱培育过夜，倒掉维持液，丙酮固定，洗1遍。
（3）加抗血清：接种标本的12孔分成3组，每组4孔，第一和第二组，分别加入工作浓度（用稀释液配制）的甲型和乙型抗血清，0.1ml/孔；第三组与细胞对照孔各加入0.1ml稀释液；接种甲型病毒和乙型病毒孔，分别加入0.1ml工作浓度的同型抗血清。置室温1h。
（4）加辣根过氧化物配标记的SPA（加何种应根据所用抗血清种类而异）倒掉孔中溶液，用洗涤液洗3～5次，最后一遍后将板孔朝下，底朝上，在普遍滤纸上轻轻敲打，将孔中溶液尽量弃尽。每孔中加入0.1ml工作浓度的辣根过氧化物酶，置室温2h。
（5）加底物：倒掉酶，按步骤4中洗之，每孔加入0.1ml底物溶液，速放暗盒中，置室温30min。
（6）结果观察：从暗盒中取出速观察之，先观察对照孔：细胞对照孔不应出颜色，最多只能出极淡的黄色；甲、乙型对照孔应出黄色（如不出，对照有问题，实验需重做）；标本接种的第一组黄色出现，第二组无色，表明分离为甲型流感病毒，反之第二组出现黄色，第一组不出，表明分离物为乙型流感病毒；第一、二组均不出现黄色，表明标本中不含有甲、乙型流感病毒。
（7）反应终止：一般不需做此步，如需测定吸光度，在每孔中加入0.05ml终止液。然后，在495nm波长下进行测定。
正常值
阴性。
化验结果临床意义
由于流感病毒感染普遍，且存在回忆反应，同时同一亚型不同年代变异毒株间均存在有不同程度的抗原性交叉，因此，患者血清中是否存在有流感病毒抗病毒抗体或抗体高低，不能做为确切诊断的证据。必须采集患者急性期（发病的头3天）和恢复期（发病后2～3周）的血清，在同一条件下进行测定，凡恢复期血清中抗体效价比急性期高4倍以上者，才可确认是流感患者。另外，由于流感病毒抗原性变异极为复杂，不同地区，甚至同一地区不同单位所流行毒株的抗原性不尽完全相同。因此，进行抗体测定时，所用的抗原最好用当时当地的流行株加上全国的代表性毒株。
附注
（1）由于流感病毒HA抗原性经常地发生变异，因此，用株特异性抗血清时，应随毒株抗原性变异而更改，否则会使鉴定敏感性下降。故应用型特异的抗血清较为合适。
（2）应用单克隆抗体时，应采用多个单克隆相混的抗体，否则会漏检。
（3）本实验在流感诊断中是个定性测定，故用肉眼观察就可。
（4）SPA不结合鸡血清中IgG，故用鸡免疫血清测定时，不能用辣根过氧化物酶标记的SPA。
（5）常规ELISA测定中所需注意事项均适合本实验。
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