微生物限度检查法
注解
微生物限度检查法系指非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检查方法。包括染菌量及控制菌的检查。
供试品应随机抽样。如遇有异常或可疑的样品，须选取有疑义的样品。一般抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍量。供试品在检验前不得开启，在检查前及检查中应防止供试品污染菌受损、致死或繁殖。凡能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出发霉、变质的药品，可直接判为不合格，无需再抽样检查。
检查的全部过程均应严格遵守无菌操作，严防再污染。
除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30～35℃，霉菌、酵母菌培养温度为25℃～28℃，控制菌培养温度为36±1℃ 。
细菌、霉菌（酵母菌）计数和控制菌检查，均应作对照试验。
检验结果的报告以1g、1ml或10cm<2>为单位。
培养基及其制备方法：
见无菌检查法（附录ⅩⅢ Ｂ）
2 、虎红琼脂培养基
胨
5g
虎红（四氯四碘荧光素）
0.0133g
10g
（或0.133％虎红溶液10ml）
磷酸二氢钾(KH2PO4)
1g
琼脂
15～20g
硫酸镁(MgSO4.7H2O)
0.5g
水
1000ml
除葡萄糖、虎红外，取上述成分，混合，加热溶化后，滤过，加入葡萄糖、虎红，分装，115℃灭菌30分钟。
胨
10g
琼脂
15～20g
酵母浸出粉
5g
水
1000ml
葡萄糖
20g
除葡萄糖外，取上述成分，混合，加热融化后，滤过，加入葡萄糖，分装，115℃ 灭菌15分钟。
胨
20g
牛胆盐
1.3g
乳糖
5g
（或去氧胆酸钠0.25g）
5g
水
100ml
磷酸氢二钾(K2HPO4)
4.0g
磷酸二氢钾(KH2PO4)
1.3g
除乳糖、牛胆盐外，取上述成分,混合,加热使溶解,调节pH值使灭菌后为7.4±0.2,煮沸，滤清，加入乳糖、牛胆盐，分装，115℃灭菌30分钟。
5 、曙红美亚甲蓝琼脂培养基(EMB)
营养琼脂培养基
100ml
2％曙红溶液
2ml
20％乳糖溶液 5ml
0.5％亚甲蓝溶液
1.3～1.6ml
取营养琼脂培养基，加热融化后，冷至60℃,按无菌操作加入灭菌的其它叁种溶液,摇匀，倾注平皿。
6 、麦康凯琼脂培养基(MaCC)
胨
20g
1％中性红溶液
2.5ml
乳糖
10g
琼脂
15～20g
牛胆盐
5g
水
1000ml
氯化钠
5g
除乳糖、1％中性红溶液、牛胆盐及琼脂外、取上述成分,混合，加热使溶解，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，加入琼脂，加热融化后，再加入其余各成分，摇匀，分装，115℃灭菌30分钟，冷至约60℃，倾注平皿。
7 、叁糖铁琼脂培养基(TSI)
胨
20g
0.2g
牛肉浸出粉
5g
0.2g
乳糖
10g
0.2％酚红溶液
12.5ml
10g
琼脂
12～15g
葡萄糖
1g
水
1000ml
氯化钠
5g
除叁糖、0.2％酚红溶液、琼脂外，取上述成分，混合，加热使溶解,调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，加入琼脂，加热融化后，滤过，再加入其余成分，摇匀，分装,115℃灭菌30分钟，制成高底层(2～3cm)短斜面。
8 、四硫磺酸钠亮绿增菌液(TTB)
胨
5g
硫代硫酸钠
30g
牛胆盐
1g
水
1000ml
碳酸钙 10g
取上述成分，混合，微温使溶解，121℃灭菌20分钟。
临用前，取上述培养基，每10ml中加入碘溶液(取碘6g与碘化钾5g，溶于20ml水中)0.2ml和0.1％亮绿溶液0.1ml ，混匀。
9 、沙门氏、志贺氏菌属琼脂培养基(SS)
胨
5g
硫代硫酸钠
8.5g
牛肉浸出粉
5g 1％中性红溶液
2.5ml
乳糖
10g 0.1％亮绿溶液
0.33ml
牛胆盐
8.5g 琼脂
20g
枸橼酚钠
8.5g
水
1000ml
1g
除糖、指示剂、琼脂外，取上述成分混合，加热使溶解，调节pH值使灭菌后为7.2 ±0.1，滤过，加入琼脂，加热融化后，121℃灭菌20分钟，再加入其余成分，摇匀，冷至约60℃，倾注平皿。
10、胆盐硫乳琼脂培养基(DHL)
胨
20g
1g
牛肉浸出粉
3g
枸橼酸铁铵
1g
乳糖
10g
1％中性红溶液
3ml
蔗糖
10g
琼脂
18～20g
去氧胆酸钠
1g
水
1000ml
硫代硫酸钠
2.3g
除糖、1％中性红溶液及琼脂外,取上述成分混合，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.2±0.1，加入琼脂,加热融化后,再加入其余成分，摇匀，冷至约60℃，倾注平皿。
11、十六烷叁甲基溴化铵琼脂培养基
胨
10g
牛肉浸出粉 3g
氯化钠
5g
琼脂
15～20g
十六烷叁甲基溴化铵 0.3g
水
1000ml
除琼脂外，取上述成分混合，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.5±0.1，加入琼脂，加热熔化后，分装，121℃灭菌20分钟，冷至约60℃，倾注平皿。
12、亚碲酸盐肉汤培养基
临用前，取灭菌的营养肉汤培养基，每100ml中加入新配制的1％亚碲酸钠（钾）溶液0.2ml，混匀，即得。
13、卵黄高盐琼脂培养基
胨
6g
10％氯化钠卵黄液 100ml
牛肉浸出粉 1.8g
琼脂
23g
氯化钠
30g
水
650ml
除10％氯化钠卵黄液外，取上述成分混合，微温使溶解,调节pH值使灭菌后为7.6±0.1。121℃灭菌20分钟，待冷至约60℃，以无菌操作加入10％氯化钠卵黄液,充分摇匀,倾注平皿。
10％氯化钠卵黄液的制备
取新鲜鸡蛋一个，以无菌操作取出卵黄，放入10％灭菌氯化钠溶液100ml中，充分振摇，即得。
14、甘露醇高盐琼脂培养基
胨
10g
1％酚红溶液
2.5ml
牛肉浸出粉 1g
琼脂
15～20g
甘露醇
10g
水
1000ml
氯化钠
75g
除甘露醇、1％酚红溶液及琼脂外,取上述成分混合，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.4±0.2，加入琼脂，加热融化后，滤过，分装，115℃灭菌30分钟，冷至约60℃,倾注平皿。
15、蛋白胨水培养基
胰蛋白胨
10g
水 1000ml
氯化钠
5g
取上述成分混合，加热融化，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，分装于小试管中,121℃灭菌20分钟。
16、磷酸盐葡萄糖胨水培养基
胨
7g
葡萄糖 5g
磷酸氢二钾(K2HPO4) 3.8g
水 1000ml
取上述成分混合，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，分装于小试管中，121℃灭菌15分钟。
17、枸橼酸盐培养基
氯化钠
5g
枸橼酸钠（无水）
2g
硫酸镁(MgSO4·7H2O)
0.2g
溴麝香草酚蓝指示液 20ml
磷酸氢二钾(K2HPO4)
0.8g
琼脂
15～20g
磷酸二氢铵(NH4H2PO4)
1g
水
1000ml
除溴麝香草酚蓝和琼脂外，取上述成分，混微温使溶解,调节pH值使灭菌后为6.9±0.1，加入琼脂，加热融化，加入指示剂混匀。分装于小试管中，121℃灭菌15分钟，置成斜面。
注：所用琼脂应不含游离糖，用前用水浸泡冲洗。
18、糖、醇发酵培养基
基础液
胨
10g
0.5％酸性复红指示剂 10ml
糖、醇 0.5％
（或溴麝香草酚蓝指示液6ml ）
氯化钠
5g
水
1000ml
取胨和氯化钠加入水中，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.4,加入指示剂混匀,分装每瓶100ml，121℃灭菌15分钟。
配制葡萄糖发酵管时，于100ml基础液中加入0.5g葡萄糖,分装于含杜氏管(Durham)的小试管中。121℃灭菌15分钟,配制其它糖醇发酵管时,将各种糖醇分别配成10％溶液,与基础液同时于121℃灭菌15分钟。以无菌操作将5ml糖醇溶液加入100ml基础液内,分装于灭菌小试管中。
注：糖醇溶液亦可采用薄膜过滤法除菌。
19、5％乳糖发酵管
胨
0.2g
乳糖
5g
氯化钠
0.3g
溴麝香草酚蓝指示液
0.6ml
磷酸氢二钠(Na2·HPO4·12H2O)
0.2g
水
1000ml
除乳糖和指示剂外，取上述成分，混合，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.4,加入乳糖及指示剂，混匀，分装于含杜氏管的灭菌小试管中，115℃灭菌15分钟。
20、尿素琼脂培养基
胨
1g
葡萄糖
1g
氯化钠
5g
20％尿素溶液 1000ml
磷酸二氢钾(KH2PO4) 2g
琼脂
20g
0.2％酚红溶液
6ml
水
1000ml
除尿素和琼脂外，取上述成分，混合，调节pH值使灭菌后为7.2±0.1，加入琼脂，加热溶化并分装于锥形瓶，121℃灭菌20分钟。冷至50～55℃,加入经薄膜过滤除菌的尿素溶液，混匀。尿素的最终浓度为2％，分装于灭菌试管中，置成斜面。
21、氰化钾培养基
胨
3g
磷酸氢二钠(Na2HPO4) 5.64g
氯化钠
5g
氰化钾试液
磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.225g
水
1000ml
除氰化钾试液外，取上述成分，混合,调节pH值使灭菌后为7.5±0.1，121℃灭菌20分钟，冷却后，每100ml培养基中加入氰化钾试液1.5ml,分装于12×100mm灭菌试管内，每管4ml，立即用灭菌橡皮塞塞紧，置4℃保存。同时，以不加氰化钾试液的培养基作为对照培养基，分装于灭菌试管中。
22、赖氨酸脱羧酶试验培养基
胨
5g
1ml
酵母浸出粉 3g
葡萄糖
1g
水
1000ml
除赖氨酸外，取上述成分，混合，加热溶解后分装，每瓶100ml。加入L-赖氨酸0.5g（DL-赖氨酸1g）调节pH值使灭菌后为6.8,同时以不加赖氨酸培养基作为对照。分装于灭菌的小试管内，每管1ml并滴加一层液体石蜡，121℃灭菌10分钟。
23、绿脓菌素(pyocyanin)测定用培养基（PDP琼脂）
胨
20g
10ml
氯化镁（无水） 1.4g
琼脂
18～20g
硫酸钾（无水）
10g
水
1000ml
取胨、氯化镁和硫酸钾加入水中，微温使深解。调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，加入甘油及琼脂，加热溶解，121℃灭菌20分钟，置成斜面。
24、明胶培养基
胨
5g
明胶 120g
牛肉浸出粉 3g
水 1000ml
取上述成分加入水中，浸泡约20分钟，随时搅拌，加热使溶解，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，分装于小试管中，115℃灭菌20分钟。
25、硝酸盐胨水培养基
胨
10g
0.5g
酵母浸出粉 3g
水
1000ml
2g
取胨及酵母浸出粉加入水中，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，加入硝酸钾和亚硝酸钠溶解，混匀。分装于含杜氏管的小试管中，115℃灭菌20分钟。
牛肉浸出粉 “Lab-lemco”powder
本品为米色粉末在水中溶解。
牛胆盐 Bile Salt Ox
本品为淡黄色或黄棕色粉末；味苦而甜；具吸湿性。在水和醇中易溶。
沙黄（番红）Safranine T [C20H19ClN4=350.85]
在水中溶解，在乙醇中易溶。
虎红（四氯四碘荧光素钠盐）Rose bengal
[C20H2Cl4I4Na2O5=1017.6]
本品为棕红色粉末。
在水中溶解，溶液呈紫色，无荧光；在硫酸中溶解，溶液为棕色。
枸橼酸铁铵
Ammonium ferric citrate
[C12H22FeN3)O14=488.16]
本品为棕红色或绿色鳞片或粉末；易潮解，见光易还原成亚铁。
在水中溶解，在醇和醚中不溶。
胰蛋白胨 Tryptone
本品为米黄色粉末。在水中溶解。
酚红 Phenol Red
[C19H14O5S＝354.38]
本品为深红色结晶性粉末。
在乙醇中溶解，在水、叁氯甲烷和醚中不溶。
DL-赖氨酸 DL-Lysine
[C6H14N2O2＝146.19]
本品为白色结晶；极易潮解。在水中溶解。
L-赖氨酸 L-Lysine
[C6H14N2O2=146.19]
在水中易溶解，在醇中微溶解，在醚中不溶。
酸性复红 Fuchsin Acid [C20H17N3Na2O9S3=585.54]
本品为绿色有金属光泽的颗料或深红色粉末。
在水中溶解，在醇中不溶。
磷酸二氢铵
Ammonium Phosphate Monobasic [NH4H2PO4=115.03]
本品为无色结晶或白色结晶性粉末。在水中溶解，在乙醇中不溶。
试液
二盐酸二甲基对苯二胺试液
取二盐酸二甲基对苯二胺0.1g，加水10ml，即得。需新鲜少量配制，于冷处避光保存，如试液变成红褐色，不可使用。
甲基红试液
取甲基红0.1g，加入乙醇300ml，使溶解后，加水至500ml，即得。
取对氨基苯甲酸0.1g，加入含有10ml水的带塞试管中，121℃灭菌20分钟。
亚碲酸钠（钾）试液
取亚碲酸钠（钾）0.1g，加新鲜煮沸后冷至50℃的水10ml使溶解。
沙黄（番红）试液
取沙黄（番红）0.25g,加乙醇10ml，使完全溶解后,加水至100ml。
无菌尿素试液
取尿素20.0g，加水100ml，充分摇匀使溶解，滤过除菌。或在尿素试液中加麝香草酚1.0g ，于室温放置1～2天，即得。配制时需无菌操作。
亚甲蓝试液
取亚甲蓝0.5g，加水溶解使成100ml。
虎红试液
取虎红0.1g，加水使溶解成75ml。
无菌枸橼酸钠－氯化钠试液
取枸橼酸钠0.5g，加0.9％氯化钠溶液10ml，121℃灭菌20分钟。
草酸铵试液
取草酸铵1.0g，加水使溶解成100ml。
亮绿试液
取亮绿0.1g，加水100ml使溶解。
结晶紫试液
取结晶紫1.0g，加乙醇20ml使溶解，加1％草酸铵水溶液80ml,混匀。静置48小时使用，置密闭棕色瓶中储存。
氢氧化钾试液
取氢氧化钾40.0g，加水使溶解成100ml。
盐酸试液
取盐酸8.4ml，加水稀释至100ml。
α-萘酚的乙醇试液
取α-萘酚6.0g，加无水乙醇使溶解成100ml。
氰化钾试液
取氰化钾0.5g，加水使溶解成100ml。
氯化叁苯四氮唑试液
取氯化叁苯四氮唑0.1g，加水使溶解10ml。
取碘化钾2.0g，加水3～5ml使溶解，加入碘片1.0g，使全部溶解后，加水稀释至300ml 。置密闭棕色瓶储存。
曙红钠试液
取曙红钠20g，加水使溶解成100ml。
靛基质试液
取对二甲氨基苯甲醛5.0g，加入戊醇（或丁醇）75ml，充分振摇，使完全溶解后，再取浓盐酸25ml徐徐滴入，加滴边振摇，以免骤热导致溶液色泽变深；或取对二甲氨基苯甲醛1.0g，加入乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取盐酸20ml徐徐滴入。
稀释剂
0.9％无菌氯化钠溶液
取氯化钠9.0g，加水使溶解成1000ml，121℃灭菌20分钟。
无菌吐温80－氯化钠溶液
取吐温80 1ml，加0.9％氯化钠溶液使成100ml,121℃灭菌20分钟。
无菌磷酸盐缓冲液(pH7.2)
取磷酸氢二钠25.8g与磷酸二氢钠4.4g，加水稀释至 1000ml，121℃灭菌20分钟。
指示液
中性红指示液
取中性红1.0g，细研，加乙醇60ml使溶解，再加水至100ml。
变色范围
pH6.8～8.0（红→黄）。
酚红指示液
取酚红1.0g，加1mol/L氢氧化钠2.82ml使溶解,再加水稀释至100ml。
变色范围
pH6.8～8.4（黄→红）。
溴甲酚紫指示液
取溴甲酚紫1.6g，加乙醇使溶解成100ml。
变色范围
pH5.2～6.8（黄→紫）。
溴麝香草酚蓝指示液
取溴麝香草酚蓝0.4g,加1mol/L氢氧化钠溶液0.64ml使溶解,再加水稀释至100ml。
变色范围
pH6.0～7.6（黄→蓝）。
酸性复红指示液(Andrade 指示剂)
取酸性复红0.5g，加水100ml,使溶解，再逐渐加入1mol/L氢氧化钠溶液16ml，每加1滴均应将溶液充分摇匀后再加第二滴,直至溶液呈草黄色；于沸水内保持15分钟，再静置2小时，滤过，即得。
变色范围
pH 6.0～7.4（黄→红）。
供试品的检验量
每批供试品检验量一般为10g 或10ml 。化学药膜剂为100cm2,贵重的或微量包装的供试品检验量可以酌减，但口服药品不得少于3g，外用药品不得少于5g。
供试品均须取自2 个以上的包装单位，大蜜丸、膜剂除须取自2 个以上包装单位外，应取自4 丸（片）以上样品。
供试液的制备
按供试品的理化特性与生物学特性可采取适宜的方法制成供试液。
1 、液体供试品
取供试品10ml，加入90ml稀释剂中，混匀，作为供试液。油剂可加适量吐温80；气雾剂以适宜方法使抛射剂导出后，加入适量稀释剂，混匀，吸取相当10g或10ml供试品，再稀释成100ml作供试液；合剂（系指含王浆或蜂蜜者，下同）与滴眼剂可用供试品作为供试液。
2 、固体、半固体或粘稠液
供试品称取供试品10g,置0.9％无菌氯化钠溶液100ml中，用匀浆仪或其它适宜方法，混匀后，作为供试液。在制备过程中，必要时可加适量吐温80，并适当加温，但不应超过45℃。
(1)非水溶性供试品
称取供试品10g(10ml)，加入灭菌吐温80
30ml、灭菌液体石蜡10ml与0.9％无菌氯化钠溶60ml(或50ml)，同置匀浆仪中，乳化,或其它适发法乳化，作供试液。在制过程中，必要时可适当加温，但不应超过45℃。
(2)不溶于水的膜剂供试品
取规定量，剪碎，加稀释剂100ml（必要时可增加稀释剂），浸泡，振摇，作为供试液。
(3)肠溶胶囊（片）供试品
称取供试品10g，置含无菌磷酸盐缓冲液(pH6.8)100ml的锥形瓶内。于45℃水浴中，保温、振摇、使溶解，作为供试液。
3 含抑菌成分供试品
供试品如干扰控制菌检验，按以下方法处理后，依法检查。
(1) 稀释法
将供试液种入较大量的培养基中，使该供试液稀释至不具抑菌作用的浓度。
(2) 离心沉淀集菌法
取规定量的供试液，离心(3000转)30分钟，弃去上清液，留底部集菌液约2ml ，再稀释成原规定量的供试液。如有不溶性药渣，可先离心(500转)5分钟，取全部上层液，再行集菌处理。
(3) 薄膜过滤法
取规定量的供试液，置稀释剂100ml中,摇匀，以无菌操作加入装有直径约50mm、孔径不大于0.45±0.02μm微孔滤膜的薄膜过滤器内，减压抽干后,用稀释剂冲洗滤膜3次，每次50～100ml，取出滤膜备检。
(4) 中和法
凡含磺胺、汞、砷类或防腐剂的供试品，可用相应的试剂钝化活性因子，中和毒性后制成供试液。
对照用菌液
控制菌检查均应作相应已知菌的对照试验。对照菌株为大肠杆菌[CMCC(B)44102]、沙门氏菌〔CMCC(B)50094〕、绿脓杆菌〔CMCC(B)10104〕及金黄色葡萄球菌〔CMCC(B) 26003〕。
取相应菌株的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物1白金耳,接种至营养肉汤培养基内，培养18～20小时后，稀释至1:10<6>。 对照菌的加入量为50～100 个。
检查法
1 、细菌、霉菌与酵母菌计数
(1) 平皿菌落计数法
取均匀供试液,进一步稀释成1:10<2> 、1:10<3>等适宜的稀释度。分别取连续叁级10倍稀释的供试液各1ml,置直径约90mm的平皿中，再注入约45℃的培养基约15ml，混匀，待凝固后，倒置培养，每稀释度应作2～3个平皿。
细菌计数用营养琼脂培养基，霉菌计数用虎红琼脂培养基，酵母菌计数用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，合剂用虎红琼脂培养基与酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基。
菌数测定空白对照试验
取供试验用的稀释剂各1ml，置4个无菌平皿中，分别按细菌、霉菌计数用的培养基制备平板、培养、检查，不得长菌。
细菌培养时间为48小时,分别在24及48小时点计菌落数,一般以48小时菌落数为准。霉菌、酵母培养时间为72小时，分别在48及72小时点计菌落数，一般以72小时菌落数为准。
营养琼脂平板一般点计细菌菌落数，虎红琼脂平板一般点计霉菌菌落数，在特殊情况下，前者同时点计霉菌、酵母菌菌落数，后者同时点计细菌菌落数。酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂平板仅点计酵母菌菌落数。液体制剂同时点计霉菌菌落数及酵母菌菌落数。含蜂蜜及王浆的合剂的霉菌、酵母菌菌落数分别测定，合并计数。菌落如蔓延生长成片，不宜计数。
点计后，计算各稀释级的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。
菌数报告规则
细菌宜选取平均菌落数在30～300之间的稀释级,霉菌宜选取平均菌落数在30～100之间的稀释级作为报告菌数计算的依据。如有1个稀释级在30～300(30～100)之间时,将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告；如同时有2个稀释级在30～300(30～100)之间时，按下式计算两级比值。
高稀释级的平均菌落数×稀释倍数
比值＝────────────────
低稀释级的平均菌落数×稀释倍数
当比值≤2时，以两稀释级的均值报告，当比值＞2时，以低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；如同时有3个稀释级的平均菌落数均在30～300之间时,以后2个稀释级计算级间比值报告；如各稀释级的平均菌落数均不在30～300之间，以最接近30或300的稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释级平均菌落数均在300(100)以上，按最高稀释级菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释级平均菌落数均小于30时，一般按最低稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告。如当1:10（或1:100 ）稀释级平均菌落数等于或大于原液（或1:10稀释级）时，应以培养基稀释法测定，按测定结果报告菌数。
(2) 培养基稀释法
取供试液（原液或1:10供试液）3份，每份各1ml,分别注入5个平皿内（每皿各0.2ml）。每1个平皿倾注营养琼脂培养基约15ml，混匀，凝固后，倒置培养，计数。每1ml注入的5个平板点计的菌落数之和，即为每1ml的菌落数，共得3组数据。以3份供试液菌落数的平均值乘以稀释倍数报告。
如各稀释级平板均无菌落生长，或仅最低稀释级平均菌落数小于1时,则报告菌数为小于10个。
2 、控制菌检查
除另有规定外，取供试液10ml(相当供试品1g、1ml 、10cm<2>),直接或处理后接种，经增菌分离培养后，进行革兰氏染色、生化试验与血清凝集试验项检查。
(1) 大肠杆菌(Escherichia coli)
取胆盐乳糖培养基3份，每份各100ml,2份分别加入规定量的供试液，其中1份加入对照菌液作阳性对照，第3份加入与供试液等量的稀释剂作空白对照。培养18～24小时（必要可延至48小时）。空白对照应无菌生长。其余2份培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板,培养18～24小时。当阳性对照的平板呈阳性菌落时,供试品的平板无菌落生长,或有菌落但不同于表1所列的特征,可判为未检出大肠杆菌。
表 1 大肠杆菌菌落形态特征
───────┬────────────────── 培养基 │ 菌 落 形 态 ───────┼────────────────── 曙红亚甲蓝琼脂│呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色， │菌落中心深紫色或无明显暗色中心，圆 │形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿 │润，常有金属光泽。 ───────┼────────────────── 麦康凯琼脂 │鲜桃红色或微红色，菌落中心深桃红色， │圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。 ───────┴──────────────────
如生长的菌落与表1所列特征相符或疑似者,应挑选2～3个菌落分别接种于营养琼脂培养基斜面，培养18小时，作以下检查：
革兰氏染色
取上述斜面培养物，涂片，固定。以结晶紫染液染色1分钟,水洗，革兰氏碘液媒染1分钟，水洗，滤纸吸干余水。以乙醇脱色20～30秒钟,水洗。滴加沙黄染液复染1分钟，待干后镜检。
乳糖发酵试验
取上述斜面培养物，接种于乳糖发酵管，培养24～48小时，观察产酸（培养基变色），产气（杜氏管内有气泡）。
靛基质试验
取上述斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基中，培养48±2小时,沿管壁加入对靛基质试液0.3～0.5ml，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。
甲基红试验
取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中,培养48±2小时，于每1ml培养液中加入甲基红指示剂1滴，立即观察，呈鲜红色或桔红色为阳性，呈黄色为阴性。
乙酰甲基甲醇生成试验（V-P 试验）
取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基，培养48±2小时，于每2ml培养液中加入α-萘酚乙醇液1ml，混匀，再加40％氢氧化钾溶液0.4ml，充分振摇，出现红色为阳性。加试剂4小时内，如出现红色亦应判为阳性，无红色反应为阴性。
枸橼酸盐利用试验
取上述斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基的斜面上，培养48±2小时,培养基斜面有菌苔生长，培养基由绿色变为蓝色时为阳性，培养基颜色无改变时为阴性。
当空白对照试验呈阴性，供试品检查为革兰氏阴性无芽孢杆菌；乳糖发酵产酸产气或产酸不产气；IMViC 试验为阳性、阳性、阴性、阴性或阴性、阳性、阴性、阴性，判为检出大肠杆菌。对可疑反应的菌株，应重新分离培养后，再作生化试验证实。
(2) 沙门氏菌(Salmonella species)
取营养肉汤培养基3份，每份各100ml,2份分别加入规定量的供试液，其中1份加入对照菌液作阳性对照，第3份加入与供试液等量的稀释剂作空白对照。培养18～24小时，空白对照应无菌生长。取其余2份培养液各1ml，分别接种于四硫磺酸钠亮绿培养基10ml中，培养18～24小时。分别划线接种于胆盐硫乳琼脂（或沙门氏、志贺氏菌属琼脂）培养基和麦康凯琼脂（或曙红亚甲蓝琼脂）培养基的平板上，培养18～24小时或延至40～48小时。当阳性对照的平板呈现阳性菌落时，供试品的平板无菌落生长，或有菌落但不同于表2所列特征时，可判为未检出沙门氏菌。
如供试品平板生长的菌落特征有与表2所列菌落形态特征相符或疑似者，均应挑选2～3个菌落分别接种于叁糖铁琼脂培养斜面上，阳性对照同时接种,培养18～24小时后，阳性对照的斜面应为红色，底层为黄色，硫化氢阳性，而供试品疑似菌斜面未见红色、底层未见黄色，可判为未检出沙门氏菌。否则，应继续做革兰氏染色、生化试验、动力检查与血清凝集试验。
表2 沙门氏菌菌落形态特征
───────┬──────────────────────────── 培养基 │ 菌 落 形 态 ───────┼──────────────────────────── 胆盐硫乳琼脂 │无色至浅橙色，半透明，菌落中心带黑色或全部黑色或无黑色。 ───────┼──────────────────────────── 沙门氏、志贺 │无色至淡红色，半透明或不透明，菌落中心有时带黑褐色。氏菌属琼脂 ───────┼──────────────────────────── 曙红亚甲蓝琼脂│无色至浅橙色，透明或半透明，光滑湿润的圆形菌落。 ───────┼──────────────────────────── 麦康凯琼脂 │无色至浅橙色，透明或半透明，菌落中心有时为暗色。 ───────┴────────────────────────────
革兰氏染色
照大肠杆菌项下方法操作，镜检。
靛基质试验
照大肠杆菌项下操作并判断结果。
尿素酶试验
取疑似菌斜面培养物接种于尿素琼脂培养基斜面上，培养24小时，斜面变为红色为阳性，不变色为阴性。
氰化钾试验
取培养20～24小时的疑似菌株营养肉汤培养液，分别用白金耳沾取1环，接种至对照培养基及氰化钾培养基内，立即以橡胶塞塞紧，培养24～48小时，对照管应有菌生长，试验管有菌生长者为阳性，无菌生长为阴性。
赖氨酸脱羧酶试验
取疑似菌斜面培养物分别接种赖氨酸脱羧酶培养基及对照培养基上。培养24～48小时，对照管应为黄色，试验管呈紫色为阳性，呈黄色为阴性。
动力检查
取疑似菌斜面培养物穿刺接种于半固体营养琼脂培养基管中，培养24小时，细菌沿穿刺线外周扩散生长，为动力阳性，否则为阴性。阴性培养物，应在室温保留2～3天后，再判断。
血清凝集试验
在洁净载玻片一端，以白金耳沾取沙门氏菌属A～F“0” 多价血清2～3环，再取斜面上部的培养物少许，与血清混合，将玻片前后侧动,如出现凝集现象,应以0.9％氯化钠溶液与同株培养物作对照试验,无凝集现象时判为血清凝集阳性。时有反应迟缓，需将玻片与湿棉球置平皿内，约过20分钟，再观察。仍未出现凝集时，应取斜面培养物，置含少量0.9％氯化钠溶液的试管中，制成浓菌悬液，在100℃水浴中保温30分钟，待冷，再作凝集试验。如出现凝集，应判为阳性，否则为阴性。
上述各项试验反应，一般应为硫化氢阳性（或阴性），靛基质阴性，尿素酶阴性,氰化钾阴性，赖氨酸脱羧酶阳性，动力检查阳性，A～F“0” 多价血清凝集试验阳性。各鉴定结果按表3判定。
表3 沙门氏菌检查结果判定
──┬─────────────────┬────┬───────── 序│ 血清凝集试验 │ │ │ (A～F“0” 血清) │ │ ├──┬───────┬──────┤生化试验│ 结 果 │凝集│ 100℃30分钟 │0.9％氯化钠 │ │ 号│反应│ 凝集反应 │溶液对照 │ │ ──┼──┼───────┼──────┼────┼───────── 1 │阳性│ 阳 性 │ 阴 性 │ 符 合│检出沙门氏菌 2 │阴性│ 阳 性 │ 阴 性 │ 符 合│检出沙门氏菌 3 │阴性│ 阴 性 │ │ 不符合│未检出沙门氏菌 ──┴──┴───────┴──────┴────┴─────────
上述各项试验任何一项不符合或有可疑反应的培养物,均应进一步鉴定后作出结论。
(3) 绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)
取胆盐乳糖培养基3份，每份各100ml，2份分别加入规定量的供试液，其中1份加入对照菌液作为阳性对照,第3份加入与供试液等量的稀释剂作空白对照。培养18～24小时，空白对照应无菌生长,其余2份培养液划线接种于十六烷叁甲基溴化铵琼脂培养基平板上，培养18～24小时。当阳性对照的平板呈现阳性菌落时，供试品的平板无菌落或无疑似菌落生长，可判为未检出绿脓杆菌。
绿脓杆菌典型菌落呈扁平、无定形、周边扩散，表面湿润，灰白色，周围时有蓝绿色素扩散。如生长菌落具有上述特征或疑似者，应挑选2～3个菌落，分别接种营养琼脂培养基斜面上，培养18～24小时，取培养物革兰氏染色，并作氧化酶试验。
氧化酶试验
取洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻璃棒取营养琼脂培养基斜面培养物涂于滤纸片上，再滴加新配制的1％二甲基对苯二胺盐酸盐试液,在30秒内呈粉红色逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性。否则为阴性。
如证实为非革兰氏阴性无芽孢杆菌或氧化酶试验阴性，均可判为未检出绿脓杆菌。否则，应进行绿脓菌素试验。
绿脓菌素(Pyocyanin) 试验
取上述琼脂斜面培养物，接种于绿脓菌素测定用培养基斜面上，培养24小时后，在试管内加氯仿3～5ml,搅碎培养基并充分振摇。静置片刻,将氯仿移至另一试管中，加入1mol/L盐酸溶液约1ml,振摇后，静置片刻，如在盐酸溶液层内出现粉红色，即为绿脓菌素阳性。试验同时应有空白对照试验。
当空白对照试验呈阴性时，供试品检查为革兰氏阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素阳性、可判定为检出绿脓杆菌。
绿脓菌素阴性的培养物，应继续以下试验。
硝酸盐还原产气试验
取营养琼脂培养基斜面培养物,接种于硝酸盐胨水培养基中,培养24小时，如在培养基的杜氏管中有气体产生，即为阳性。
42℃生长试验 营养琼脂培养基斜面培养物于0.9％无菌氯化钠溶液中,制成菌悬液,再将菌悬液接种于营养琼脂培养基斜面上，立即置41±1℃水浴中培养24～48小时,有菌苔生长者为阳性；否则为阴性。
明胶液化试验
以接种针沾取营养琼脂培养基斜面培养物，穿刺于明胶培养基内，培养24小时，取出置冰箱内10～30分钟。如培养基仍呈溶液状，为阳性。
当革兰氏阴性杆菌，氧化酶试验阳性，绿脓菌素试验为阴性，其硝酸盐还原产气试验、42℃生长试验及明胶液化试验均为阳性时，应判为检查绿脓杆菌。
(4) 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
取亚碲酸钠肉汤（或营养肉汤）培养基3份，每份各100ml，2份分别加入规定量的供试液，其中1份加入对照菌液作为阳性对照，第3份加入与供试液等量的稀释剂作为空白对照。均培养18～24小时(必要时可延至48小时)。空白对照应无菌生长。取其余2份培养液划线接种于卵黄高盐琼脂培养基平板上或甘露醇高盐琼脂培养基平板上，培养24～72小时。当阳性对照的平板呈现阳性菌落时，供试品的平板如无菌落生长，或有菌落但不同于表4所列特征,可判为未检出金黄色葡萄球菌。
表4 金黄色葡萄球菌菌落形态特征 ─────┬───────────────── 培养基 │ 菌 落 形 态 ─────┼───────────────── 卵黄高盐 │金黄色、圆形凸起，边缘整齐，外围有琼脂 │卵磷脂分解的乳浊圈，菌落直径1～2mm ─────┼───────────────── 甘露醇高盐│金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有琼脂 │黄色环，菌落直径约0.7～1mm ─────┴─────────────────
如有菌落生长并与表4所列特征相符或疑似时,应挑选2～3个菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养18～24小时，取其培养物革兰氏染色，并作血浆凝固酶试验。
血浆凝固酶试验
取灭菌小试管3支，各加入血浆①－无菌水(1:1)0.5ml，1支加入被检菌株的营养肉汤培养液（或浓菌悬液）0.5ml,其余2支作对照管；1支加入金黄色葡萄球菌的营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml作阳性对照;另1支加入营养肉汤或0.9％氯化钠溶0.5ml作空白对照。将3管同时培养。3小时后开始检查,以后适当时间逐次观察直至24小时。空白对照管的血浆流动自如，阳性对照管血浆凝固，试验管血浆凝固者为阳性；阳性对照管和空白对照管任何一管不符合要求时，应另制备血浆，重新试验。
当空白对照和阳性对照符合要求，供试品的菌株为革兰氏阳性球菌、血浆凝固酶试验阳性，判定为检出金黄色葡萄球菌。
结果判断
细菌菌落数、霉菌（酵母菌）菌落数、控制菌叁项均符合该品种微生物限度项下规定，应判供试品合格；其中任何一项不符合该品种项下规定，应判供试品不合格。
细菌菌落数、霉菌(酵母菌)菌落数第一次测定超过该品种项下微生物限度规定时，应从同一批号样品中随机抽样，复试两次，以叁次结果平均值报告。
眼科用药的霉菌和酵母菌菌落数复试报告，须以二次复试结果均不得长菌，方可判为供试品合格。
如发现营养琼脂培养基平板生长霉菌（酵母菌）菌落数或虎红琼脂培养基平板上生长细菌菌落数超过该品种项下微生物限度规定时，应判为供试品不合格。
各类制剂检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再抽样复试，即应判该供试品不合格。
①
血浆的制备
以无菌注射器吸取灭菌的含5％枸橼酸钠的0.9％氯化钠溶液1ml,用无菌操作采取家兔（或羊、人）血9ml,轻轻混匀数分钟。待血液不凝固时，徐徐放入灭菌离心管中，离心，分离血浆，用灭菌吸管取血浆移至灭菌试管中，置冰箱内备用。临用前必须用已知血浆凝固酶试验阳性的金黄色葡萄球菌测试，证明血浆合格后，方可用于试验。
