弓形虫感染
概述
弓形虫感染（toxoplasma infection）是指弓形虫经人体消化道黏膜、损伤的皮肤、胎盘等途径随血液或淋巴液扩散到全身有核细胞内，形成包囊后可长期寄生于中枢神经系统或横纹肌内，免疫功能正常情况下可不出现明显临床症状和体征，仅弓形虫病原学阳性。有先天性和获得性两种感染途径。
弓形虫
弓形虫（toxoplasma）是一种寄生于人和动物体内的原虫，可寄生于人体几乎所有有核细胞内，因滋养体似弓形或半月形而被命名为弓形虫，可引起人体弓形虫感染或弓形虫病。
弓形虫最早发现于刚地梳趾鼠（Ctenodactylus gondii）体内单核细胞中，是一种能寄生于人体几乎所有有核细胞内的原虫，猫科动物为其唯一终末宿主，其他哺乳动物、鸟类和人类都可为其中间宿主。其发育全过程有滋养体（包括速殖子和缓殖子）、包囊、裂殖体、配子体和卵囊等5种生活史阶段，临床上有诊断价值的为速殖子（假包囊）和包囊。
弓形虫的形态
速殖子（假包囊）
速殖子（tachyzoite）呈香蕉形或半月形，前端较尖，后端较钝。长3μm～7μm，最宽处2μm～4μm。经Giemsa法染色后胞浆呈蓝色，胞核呈紫红色，位于虫体中央稍偏后。
细胞内寄生的速殖子不断增殖，一般含数个至十多个，其被宿主细胞膜包绕的虫体集合体没有真正的囊壁，称为假包囊（pseudocyst）。
包囊
包囊（cyst）呈圆形，具有由虫体分泌的一层富有弹性的坚韧囊壁，内含数十个至数千个缓殖子（bradyzoite）。缓殖子直径范围为5μm～100μm，多见于脑、骨骼肌、视网膜及其他组织内，可长期在组织内生存。
弓形虫的生活史
在终宿主体内的发育过程：猫科动物吞食卵囊、包囊或假包囊后，在小肠内逸出子孢子、缓殖子或速殖子，侵入小肠上皮细胞发育增殖，形成裂殖体。裂殖体成熟后释出裂殖子，再侵入其他肠上皮细胞形成下一代裂殖体。经过数代后，部分裂殖子发育为雌、雄配子体，再继续发育为雌、雄配子。雌、雄配子受精成为合子，继续发育形成卵囊，从上皮细胞内逸出进入肠腔，随粪便排出体外。在25℃温度和适宜湿度环境条件下，经2 d～4 d发育为具有感染性的成熟卵囊。同时，弓形虫也可在猫科动物的肠外组织中进行无性增殖。
在中间宿主体内的发育过程：当猫粪内的卵囊或动物肉类中的包囊或假包囊被人、羊、猪、牛等中间宿主吞食后，在肠内逸出子孢子、缓殖子或速殖子，侵入肠壁经血或淋巴液进入单核巨噬细胞内寄生，并扩散到全身各组织器官，如脑、眼、肝、心、肺、肌肉等，进入细胞内以二分裂或内芽生增殖形成假包囊，当细胞破裂后，速殖子侵入其他组织细胞。当机体免疫功能正常时，部分速殖子侵入宿主细胞，特别是脑、眼、骨骼肌等组织，虫体增殖速度减慢并分泌囊性物质形成包囊。包囊在宿主体内可存活数月、数年或更长时间。当机体免疫功能低下或缺陷时，可诱发包囊发育而破裂，释出缓殖子，进入血流并侵入其他组织细胞形成假包囊，继续发育增殖。
弓形虫感染的流行病学
弓形虫是重要的机会性致病寄生虫，呈世界性分布，人群感染相当普遍，多属隐性感染。全国人畜弓形虫病调查研究协作组（1983年～1986年）采用IHA方法调查19个省（直辖市、自治区）141个县的81968名居民，结果血清弓形虫抗体阳性率为0.33%～11.79%，平均阳性率为5.16%。全国人体重要寄生虫病现状调查（2001年～2004年）报告，采用ELSA方法在15个省（直辖市、自治区）检测47444人，结果血清抗体阳性率为0.79%～16.810/，平均阳性率为7.88%，抗体阳性率随年龄增加呈上升趋势。
传染源
随粪便排出弓形虫卵囊的猫科动物是最重要传染源，其次为感染弓形虫的其他哺乳动物、鸟类等温血动物。弓形虫可通过胎盘感染胎儿，故受感染的母亲也是传染源。
传播途径
先天性弓形虫感染是指经母体胎盘感染胎儿；获得性弓形虫感染是指经人体消化道黏膜、损伤皮肤、输血、器官移植等途径传播。
易感人群
人类对弓形虫普遍易感，尤其是胎儿、婴幼儿、饲养或接触猫犬等宠物者、动物饲养员、屠宰工以及各种免疫功能低下或缺陷者。
流行因素
弓形虫卵囊在外界具有较强的抵抗力，寒带、温带、热带地区均有分布，没有严格的地理分布界线。人群感染弓形虫与饲养宠物、饮食习惯等有关。在食品加T过程中，如生熟不分造成交叉污染可增加弓形虫感染机会。
弓形虫感染的临床表现
弓形虫感染有先天性和获得性两种途径。妇女在妊娠期感染弓形虫后多数可造成胎儿先天性感染，一般婴幼儿期常不出现明显临床症状和体征。当各种原因造成免疫功能低下时，儿童期可呈现中枢神经系统损害表现，成人期可出现视网膜脉络膜炎等。妇女妊娠初期感染弓形虫后少数可出现流产、早产、死产或畸形，妊娠中晚期感染弓形虫可造成胎儿出生后有脑、眼、肝、心、肺等部位的病变或畸形。
免疫功能正常者获得性感染弓形虫后，多数不出现明显临床症状和体征，为隐性感染。当免疫功能低下或缺陷时，弓形虫可侵犯人体各个器官而引起相应严重临床表现，如弓形虫脑病、弓形虫眼病、弓形虫肝病、弓形虫心肌心包炎、弓形虫肺炎等。
免疫功能正常者感染弓形虫后，包囊可长期寄生于中枢神经系统或横纹肌内，临床上多无明显症状和体征，仅弓形虫病原学检测阳性。
弓形虫的实验室检查
弓形虫IgG抗体检测
方法
采用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）法，检测人血清、血浆或其他体液样品中弓形虫IgG抗体。
试剂组成
由弓形虫抗原包被的96微孔板、人葡萄球菌蛋白A（SPA）或抗人IgG酶标记物液、样本稀释液（含0.9%氯化钠的生理盐水）、洗涤液（含有Tween-20缓冲液）、终止液（主要成分为1 mol/L硫酸溶液）、阳性对照、阴性对照、底物A液（主要成分为过氧化脲）、底物B液（主要成分为四甲基联苯胺）组成。
操作步骤
在洁净试管中加入1 mL稀释液，然后加10μL待检样品液，混匀。每孔中加入稀释的待检样品100μL，设阳性对照1孔，阴性对照2孔（每孔分别加阳性对照、阴性对照2滴），并设空白对照1孔，置37℃孵育30 min。随后弃去孔中液体，用洗涤液洗涤5次，每次间隔1 min，甩干。除空白对照孔外，每孔加入1: 50稀释的酶标记物液50μL（即1 mL稀释液中加入酶结合物20μL），37℃孵育30 min。随后弃去孔中液体，用洗涤液洗涤5次，每次间隔1 min，甩干。每孔先后加底物A液、底物B液各1滴，轻叩反应板使之混匀，室温避光放置5 min～10 min。每孔加终止液1滴。
结果判定
采用比色计数法，以空白孔调零，用酶标仪测定各孔450 nm波长OD值。如S/N（样品孔OD值／阴性对照孔OD均值）≥2.1，结果判为阳性。
弓形虫IgM抗体检测
方法
采用抗体捕捉ELISA法，检测人血清、血浆或其他体液样品中弓形虫IgM抗体。
试剂组成
由抗人IgM-μ链抗体包被的96微孔板、弓形虫抗原液、抗弓形虫抗体酶标记物液、样本稀释液、洗涤液、终止液、阳性对照、阴性对照、底物A液、底物B液组成。
操作步骤
每孔中加稀释液90μL，然后加待检样品液10μL，充分混匀，设阳性对照1孔，阴性对照2孔（每孔分别加阳性对照、阴性对照2滴），并设空白对照1孔，置37℃孵育30 min。随后弃去孔中之液体，用洗涤液洗涤5次，每次间隔1 min，甩干。除空白对照孔外，每孔先加入抗原液1滴，随后加1: 50稀释的酶标记物液50μL（即1 mL稀释液中加入酶结合物20μL），轻叩反应板使之混匀，37℃孵育30 min。随后弃去孔中之液体，用洗涤液洗涤5次，每次间隔1min，甩干。每孔先后加底物A液、底物B液各1滴，轻叩反应板，室温避光放置10 min～20 min。每孔加终止液1滴。
结果判定
采用比色计数法，以空白孔调零，用酶标仪测定各孔450 nm波长D值。如S/N（样品孔OD值／阴性对照孔OD均值）≥2.1，结果判为阳性。
弓形虫IgG抗体和IgM抗体的临床意义与处理方法
弓形虫抗体检测是目前最主要的辅助检查方法，通常需联合进行IgG和IgM抗体平行检测，弓形虫血清学抗体检测结果的临床意义见表D.1。怀疑孕妇近期感染，采取干预措施之前应将标本送至有诊断弓形虫病经验的实验室比对。
表D.1 弓形虫IgG抗体和IgM抗体的临床意义与处理方法
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IgG结果 |
IgM结果 |
临床意义 |
处理方法 |
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阴性 |
阴性 |
无弓形虫感染的血清学证据 |
如果临床症状和体征持续存在，3周后重新采集标本复查 |
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阴性 |
可疑阳性 |
可能早期急性感染或IgM假阳性 |
3周后重新采集标本检测IgG和IgM。如果两份结果相同，患者可能未感染弓形虫 |
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阴性 |
阳性 |
近期急性感染或IgM假阳性 |
3周后重新采集标本检测IgG和IgM。如果两份结果相同，IgM反应可能是假阳性 |
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可疑阳性 |
阴性 |
不确定 |
重新采集标本检测IgG |
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可疑阳性 |
可疑阳性 |
不确定 |
重新采集标本检测IgG和IgM |
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可疑阳性 |
阳性 |
可能近期急性弓形虫感染 |
3周后重新采集标本检测IgG和IgM |
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阳性 |
阴性 |
通常弓形虫感染超过6个月 |
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阳性 |
可疑阳性 |
弓形虫感染，但IgM结果可疑可能由于近期感染或IgM假阳性 |
3周后重新采集标本检测 |
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阳性 |
阳性 |
可能近期弓形虫感染 |
弓形虫CAg检测
方法
采用ELISA双夹心一步法，检测人血清样品中弓形虫CAg。
试剂组成
由纯化抗弓形虫特异性抗体（多抗）包被的96微孔板、抗弓形虫特异性抗体酶标记物液、样本稀释
液、洗涤液、终止液、阳性对照、阴性对照、底物A液、底物B液组成。
操作步骤
每孔中加稀释液40μL，，然后加待测样品液10μL，充分混匀，并设阳性对照1孔，阴性对照1孔、空白对照1孔（每孔分别加阳性对照、阴性对照、稀释液各1滴）。除空白对照外，各孔随后加稀释的酶标记物液50μL，轻叩反应板使之混匀，置37℃孵育1 h。随后弃去孔中之液体，用稀释液洗涤5次，每次间隔1 min，甩干。每孔先后加底物A液、底物B液各1滴，室温避光放置10 min～20 min。每孔加终止液1滴。
结果判定
采用比色计数法，以空白孔调零，用酶标仪测定各孔450 nm波长OD值。如S/N（样品孔OD值／阴性对照孔OD均值）≥2.1，结果判为阳性。
弓形虫核酸检测
方法
采用聚合酶链式反应（PCR）技术，从Bl基因和AF146527序列等选取靶基因，对弓形虫特异性DNA核酸片段进行荧光PCR检测。
试剂组成
由核酸抽提液、弓形虫核酸荧光PCR检测混合液、酶（Taq+UNG）、水（H2O）、内部对照品、阳性对照品组成。
操作步骤
首先进行标本、对照品的核酸裂解处理。如为血液或体液，取50μL样本，加50μL核酸提取液，振荡10 s，99℃干浴或水浴10 min，2500 g离心10 min，保留上清备用。如为粪便，挑取米粒大小粪便放置于含0.5 mL生理盐水的离心管中，振荡混匀，2500 g离心2 min，去尽上清，沉淀中直接加入100μL DNA提取液充分混匀，沸水浴10 min，2500 g离心5 min，取上清4V_L进行PCR反应，取水（H2O）作为阴性对照。然后进行试剂配制，取35μL弓形虫核酸荧光PCR检测混合液与1μL内部对照品，以及0.4μL酶（Taq+UNG），振荡混匀数秒，1358 g离心数秒。取上述混合液36μL置于PCR反应管，然后将已处理标本、阳性对照品、水（H2O）各4μL分别加入PCR反应管，盖好管盖，置于定量荧光PCR仪上，分别设置循环参数为37℃2 min、94℃2 min、93℃15 s、60℃60 s，四个参数循环40次。单点荧光检测在60℃，反应体系为40μL。荧光检测选用羧基荧光素（FAM）和六氯荧光素（HEX）通道，基线调整取6～15个循环的荧光信号，阈值设定原则以阈值线刚好超过水（H2O）检测荧光曲线的最高点。
结果判定
在FAM通道，当Ct（Crossing point）值≤38时，结果判为阳性。
病原学检查
直接镜检
取外周血或脑脊液、视网膜下渗出液、房水、胸水、腹水、羊水等待检血液或体液，500 g离心10 min，取沉淀液进行涂片，经干燥、固定和Giemsa法染色，光镜下如查到弓形虫速殖子（假包囊）则判为病原学阳性。
取活检组织，病理切片后经Giemsa法染色，光镜下如检测到弓形虫包囊或速殖子（假包囊）则判为病原学阳性。
动物接种
取外周血或脑脊液、视网膜下渗液、房水、胸水、腹水、羊水等待检血液或体液，无菌接种于6周～8周龄清洁级健康小鼠腹腔内，每只接种1mL。逐日观察，如接种2周～3周后如小鼠jLH现皮毛松竖、不活泼、弓背、闭目、腹部膨大、颤动或呼吸急促等症状，应立即剖杀。取小鼠腹腔液以及肝、脾、脑等组织，经研磨过滤500 g离心10 min后制成涂片，Giemsa法染色后镜检，如查到弓形虫速殖子（假包囊）或包囊则判为病原学阳性。
如首次接种结果为阴性或小鼠未发生死亡，无菌取其脑、肝、心、肺、淋巴结等组织各2 g，放入组织研钵中研磨成匀浆，加0.9%生理盐水配制成10%～20%的组织悬浮液，再次接种6周～8周龄清洁级健康小鼠腹腔内。小鼠盲传至少3代，每2周1次，如查到弓形虫则判为病原学阳性。
弓形虫感染的诊断
弓形虫感染根据流行病学史、临床表现及实验室检查结果等予以诊断。
同时符合以下情况者可诊断弓形虫感染：
1.无明显临床症状和体征，有猫、犬等宠物饲养或接触史，或有生食或半生食猪、羊、牛、犬等动物肉类及其制品史，或有皮肤黏膜损伤、器官移植输血史，或有免疫功能低下或缺陷史，或妇女妊娠期有上述暴露史等.
2.血液、体液或穿刺液涂片或病理切片染色镜检发现弓形虫；或者血液、体液或穿刺液经动物接种分离发现弓形虫。
弓形虫感染的鉴别诊断
先天性弓形虫感染
应与巨细胞病毒感染、疱疹病毒感染、风疹病毒感染等疾病进行鉴别。
巨细胞病毒感染
婴儿感染巨细胞病毒后，可以出现肝脾肿大、血小板减少、小头畸形等临床表现，尿中可查到巨细胞病毒包涵体，鼻咽部、血或尿中可分离出巨细胞病毒，血清巨细胞病毒特异性抗体检测阳性等。
疱疹病毒感染
婴儿感染疱疹病毒后，可以出现高热、热退疹出或疹出热退、颈周淋巴结肿大等临床表现，脑脊液呈病毒感染改变，外周血白细胞总数减少，淋巴细胞增多，血清疱疹病毒特异性抗体检测阳性等。
风疹病毒感染
婴儿感染风疹病毒后，可以出现发热、黏膜玫瑰色或出血点、肌张力低下等临床表现。出生前诊断主要依据从羊水中分离到风疹病毒，出生后诊断则主要依据从喉、尿液、脑脊液和其他组织中分离到风疹病毒，血清风疹病毒特异性抗体检测阳性等。
获得性弓形虫感染
应与传染性单核细胞增多症、淋巴结结核、视网膜脉络膜炎等疾病进行鉴别。
传染性单核细胞增多症
约有10%获得性弓形虫病误诊为传染性单核细胞增多症。传染性单核细胞增多症的异型淋巴细胞常占白细胞总数10%以上，无嗜酸粒细胞增多，血清嗜异性凝集抗体滴度≥1：64；而弓形虫病的异型淋巴细胞常占白细胞总数10%以下，可有轻度嗜酸粒细胞增多，血清嗜异性凝集抗体阴性等。
淋巴结结核
以颈部淋巴结结核最常见，主要侵犯颌下、颈前区沿胸锁乳突肌前缘等部位的淋巴结，常为一侧性，可以软化后变为冷性脓肿，向外穿破而遗留瘘管，结核菌素试验常呈阳性反应；而弓形虫性淋巴结炎也以颈部多见，但炎症发展缓慢，肿大程度常不出现压迫症状，血清弓形虫特异性抗体或抗原试验阳性等。
视网膜脉络膜炎
巨细胞病毒感染、结核病、梅毒、钩端螺旋体病、布鲁氏菌病、组织胞浆菌病、类肉瘤病等均可引起视网膜脉络膜炎，但弓形虫引起的视网膜脉络膜炎特征性损伤为眼底局灶坏死性脉络膜炎，表现为视力模糊、盲点、怕光、疼痛、泪溢、中心性视力缺失等。
