心肌酶谱

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心肌酶检查,检查心肌酶主要是确定心肌缺血坏死细胞膜通透性。

1.血清酶总论:P232

LDH、AST、CK及其同I酶,α-HBD  

一、血清酶的来源和分类:

(一)根据来源及血浆中发挥作用:

1.血浆持异酶:主要在血浆中发挥催化作用的酶类

eg:凝血酶原凝血因子(X、ⅫI、Ⅶ)纤溶酶原,前激肽释放酶

假性胆碱脂酶:铜蓝蛋白脂蛋白脂肪酶肾素

假性胆碱脂酶:水解可能干扰乙酰胆碱酶活性的一些化合物

铜蓝蛋白:是一种氧化酶,与Fe蛋白,动员有关

脂蛋白脂肪酶:参与脂蛋白中脂肪的水解和储存

2.外分泌

eg:唾液胰淀粉酶胰脂肪酶胃蛋白酶胰蛋白酶前列腺酸性磷酸酶等。

在血浆中很少发挥催化作用

其浓度与其分泌腺体的功能有关

3.细胞酶:存在于各细胞和组织中进行物质代谢的酶类

血液中无重要的催化作用

(1)一般代谢酶:无器官特异性

(2)组织专一性酶:OCT、SDH、ADH主要存在于肝。其活性能较特异地反映肝cell的病变。

(二)根据酶促反应性质可将酶分为六类:

1.氧化还原酶类:催化底物进行氧化还原反应。eg:LDH

CHO CHO

C=0+NADH+H+ LDH CH-OH+NAD+

COOH COOH

丙酮乳酸

eg:LDH琥珀酸脱氢酶细胞色素氧化酶过氧化物酶

2.转移酶类:催化底物之间进行某些基团的转移或交换的酶类

COOH CH3 COOH CH3

(CH2)2 +HC-NH2 ALT (CH2)2 + C=0

C=0 COOH HC-NH2 COOH

COOH COOH

α-酮戊二酸 丙氨酸 谷氨酸 丙酮酸

eg:转氨酶已糖激酶磷酸化酶

3.水解酶:催化底物之间发生水解反应的酶类

eg:淀粉酶蛋白酶脂肪酶磷酸酶

ALP

对-硝基苯磷酸盐对-硝基苯酚+磷酸盐

水解

4.裂解酶类:催化底物移去一个基因而留下双键的反应或逆反应的酶类。

eg:碳酸酐酶醛缩酶

5.异构酶类:催化各种同分异构体之间互相转化的酶类

eg:磷酸已糖激酶消旋酶

磷酸已糖激酶

6-磷酸葡萄糖6-磷酸果糖

6.合成酶类(连接酶类):催化两分子底物合成-分子的化合物,同时必须偶联有ATP磷酸键断裂。  

二、血清酶的命名:

1.习惯命名法:根据酶来源,催化反应性质及底物来命名。

底物:淀粉酶,蛋白酶

性质:脱氢酶、转移酶

来源:胰淀粉酶、胃蛋白酶

底物+性质:谷草转氨酶

2.系统命名法:酶反应底物、性质均要列出,各底物间以“:”隔开

编号:(1)1为氧化还原酶类

2为转移酶类

3为水解酶类

4为裂解酶

(2)反应作用的位置,即可用于哪个基因

1.1 -CH-OH

1.2 -C=0

1.3 -C=CH

1.4 -C=NH

1.5 -CH-NH2

1.6 NADH、NADPH

(3)

1.1.1 氯化还原酶 CH-OH 受体:NAD+ NADP-

1.1.2 氯化还原酶 CH-OH 受体:细胞色素

1.1.3 氯化还原酶 CH-OH 受体:分子氧  

三、血清酶的去路:

(一)血清酶的排泄:P234

1.尿路:是血清低分子量酶类主要去路

2.胆汁不是血清酶排泄途径

(二)肝或网状内皮系统对血清酶的清除:

肝脏对以酶原形式存在的酶类有消除作用

(三)酶蛋白血管内的失活和分解:

(四)转入其它体液  

四、酶的活性单位及生理差异:

(一)酶的活性单位:在规定条件,每分钟催化1umol的基质发生转化所需要的酶量。

规定条件包括:温度、PH、缓冲系统、基质浓度及辅助因素

(二)酶的单位计算

1.根据标准计算:

(U/L)酶活力单位=A样品/A标准×C标准×Vt/Vs×1/t×1000

总体积-样品+基质

2.根据反应底物的消光系数:

酶活力=A样品/ξd×Vt/Vs×1/t×1000

消光系数 比色杯厚度

(三)血清酶的生理差异:

1.性别:男>女

2.年龄:儿童 磷酸酶>成人 婴儿 LDH 2倍成人

3.进食:对酶活力本身无影响,但可影响比色时的浊度

4.活动:

5.妊娠:ALT、LDH、ALP↑  

五、疾病时血清酶改变的机制:

(一)合成异常:P238

1.合成减少

2.合成增加

(二)酶从损伤细胞中释放增加:

是疾病时大多数血清酶↑的主要机制

(三)其它机制:

肾衰尿少→ 血淀粉酶↑

药物,毒物可作为酶的抑制剂

2.AST的测定:

AST 谷草转氨酶(GOT)

天门冬氨酸氨基移换酶

一、AST分布:

广泛分布于人体各组织、器官中,主要在心、肝、骨骼肌、肾、胰、脾、肺、RBC中。其中以心肌cell含量最丰富。

主要存在线粒体中(M-AST)。胞浆中(C-AST)仅占12%,是可溶性的正常血清中AST很少,只有上述组织发生病变

时,才释放入血。  

方法学介绍

(一)赖氏比色法:<实验>P115

1.原理:

COOH COOH COOH COOH

(CH2)2 + CH2 AST (CH2)2 + CH2

C=O HC-NH2 37℃ HC-NH2 C=0

COOH COOH COOH COOH

酮戊二酸 天门冬氨酸 谷氨酸 草酰乙酸

COOH CH3

CH2 柠檬酸苯胺 C=0+CO2

C=0 脱羧 COOH

COOH

丙酮酸

CH3

C=0 + →丙酮酸-2.4- = +H2O

COOH 硝基苯腙

2.4-二硝基苯肼 酸性,草黄色,加碱,棕红色

与标准浓度丙酮酸生成的苯腙比色(505nm)

2.正常参考值:8-28u

3.注意事项

(1)溶血标本不能用于AST测定,因为RBC中AST是血清10倍。

(2)M-AST、C-AST理化性质,Ag性均不同,由不同基因控制,但催化相同反应,是同I酶

(3)赖氏比色法简易性,相对准确性,所以是普及的原因

(4)难以确定在酶反应期内,产物的生成与时间成正比。

草酰乙酸是AST竞争抑制剂,随反应进程,产物,酶反应不断。

(5)显色反应及底物浓度问题。

酮戊二酸也可与2.4-二硝基苯肼反应,产生另一棕色苯腙,使AST测定假阳性增高。

为了减少其干扰,波长选在490-530nm,此时丙酮酸为-酮戊二酸2倍

2.4-二硝基苯肼在碱性溶液中也可呈色,使吸光度伪性增高。

(6)A、偶联转氨作用:

ALT

丙酮酸+谷氨酸丙氨酸

所以肝疾病AST、ALT同时,使丙酮酸消耗,AST测定结果减低。

B、产物旁路

乳酸

LDH ↑NADH+H+

丙酮酸

α-酮戊二酸+天门冬aa AST 草酰乙酸+谷aa.

↓MDH+NADH+H+

苹果

所以受LDH、MDH干扰,使AST测定结果减低

(二)酶偶联一些外连续监测法:

1.原理:L-天门冬aa.+α-酮戊二酸 AST 草酰乙酸+谷aa.

草酰乙酸+NADH+H+ MDH L-苹果酸+NAD+

340nm

吸光度下降值,计算AST活力

2.参考值:男<40u/L 37℃

女<35u/L 37℃

3.注意事项:

(1)采血后立即分离血清,避血溶血

血清与血块不可长时间设置在一起

(2)血清,室温4-8h,2-6℃ 7d -20℃ 8月 活力不变

(3)抗凝剂血浆:

EDTA、2Na,肝素对AST无抑制作用

不能用草酸盐抗凝剂,因为可抑制AST活性

(4)AST浓度过高,稀释重做。

(5)不存在偶联转氨作用和产物旁路问题

(6)不存在 酮戊二酸干扰,可适当提高底物浓度使反应完全

(7)底物中存在谷氨酸脱氢酶(GLDH)

α-酮戊二酸+NADH+H++NH3 GLDH 谷aa.+NAD++H2O

消耗NADH+H+,使结果伪性增高。

(8)轿清中丙酮酸LDH

丙酮酸+NADH+H+ LDH 乳酸+HAD+

消耗NDAH+H+,使结果偏高

(9)在指示酶作用有,草酰乙酸可自动脱羧生成丙酮酸,使结果偏低。应加LDH,使之成为乳酸,从而更加准

确反映AST活力。

所以MDH、LDH共同作为指示酶

三、临床意义:

1.AST在心肌中含量最多,所以在急性心梗时6-12h↑,48h达高峰,3-5d恢复正常

2.急性肝炎,手术后,药物中毒,AST明显↑

肝Ca、慢性肝病心肌炎,AST中度

肌炎胸膜炎肾炎,AST轻度

3.急性肝炎,AST,ALT同时↑,可达正常值10-30倍,黄疸前期就已↑,有助于临床早期诊断。

3.AST同I 酶:

<黄>血清酶测定时诊断心梗的意义:

心肌C、肝C出现实质性损害 M-AST C-AST↑

M-AST↑对肝病预后有一定诊断意义

心梗M-AST↑ 所以M-AST越↑,心梗并发心衰发病率死亡率越↑,尤其推测死亡率方面意义更大。

4.血清乳酸脱氢酶的测定: 原理 PH对其影响 

LDH 糖酵解酶,氧化还原反应

有五种同I酶LDH1-LDH5

一、LDH分布和特点:

广泛分布,主要在肾,其次心,骨骼肌,其它肝、脾、胰、肺,上述组织病变,血清中LDH。主要催化以下反应:

L-乳酸+NAD+ 丙酮酸+NADH+H+

PH碱 正反应(L-P)

PH中性 逆反应(P-L)

二、方法学

(一)比色法:<实验>P122

1.原理:L-乳酸+NAD+ LDH 丙酮酸+NADH+H+

PH8.8

丙酮酸+2.4-二硝基苯肼 → 丙酮酸-2.4-二硝基苯

酸 草黄色

加NaOH 棕红色

颜色越深,酶活力越大

2.参考值:225-540u/dL

3.注意事项:产物生成量与反应时间不成比例

(1)标本严禁溶血 因为RBC内LDH活力是血清内的100倍。

(2)LDH受重金属盐、EDTA、草酸盐的抑制。最好用血清标本

(3)血清标本2-6 数天,室温48h

(4)准确性和重复性在酶学检验中最差,因为五种同I酶与底物结合能力不同,最适反应条件不同,在病理

LDH组成差异大,所以很难找出LDH最适反应条件。eg:心梗LDH1↑,肝病LDH5↑

(5)结果>2500u/dL,将标本稀释重做。

(二)连续监测法(酶法):<实验>P120

1.原理:L-乳酸+NAD+ PH8.8-9.8 丙酮酸+NADH+H+

逆反应比正反应速度快2-3倍 所以反应偏向左侧,多用P-L

LDH

丙酸酸+NADH+H+乳酸+NAD+

PH7.4

340nm处监测,吸光度下降幅度与LDH成正比。

2.参考值:240-460u/L 37℃

3.注意事项:

(1)逆反应优点:

a.试剂用量少,所需NAD+,只是L-P所用NADH+H+的3%,样品少

b.单位时间内吸光度变化大,逆反应线性范围较大,酶促反应速率比正反应快3倍,利于测定。 时间短

c.酶活力随时间的线性关系较长

(2)正反应优点:

a.NADH+H+比NAD+稳定,价格低,易得到纯品。

底物L-乳酸与逆反应底物丙酮酸稳定

b.L-乳酸对LDH的抑制低于丙酮酸对LDH的抑制

(3)连续监测法可利用正、逆反应,优于比色法。

(4)金属离子的存在可以降低NAD+稳定性

试剂中可加入EDTA,使EDTA络合金属离子,增加NAD+稳定。

(5)NAD+不稳定,产生对LDH有抑制作用的物质。在碱性液中比在酸性液中稳定,在Tris缓冲液中比在磷酸

盐缓冲液中稳定。

(6)某些批号的NADH+H+还有LDH的物质,使用前检查NADH+H+质量,NADH+H+溶于Tris缓冲液,分别在

260nm和340nm测吸光度,应<2.3,若>2.3,说明含有在260nm处有吸收峰的杂质,如NAD+、腺苷

(7)α-酮丁酸羟基丙酮酸、乙醛酸可代替丙酮酸作底物。

(8)标本不能溶血

三、临床意义:

1.LDH↑:急性心梗、骨骼肌损伤、某些肝炎白血病肝硬化阻塞性黄疸恶性肿瘤

2.心梗:12-24h,LDH↑,48-72h达高峰,1-2W后恢复正常

3.恶性肿瘤晚期LDH,恶性肿瘤引起的胸腹水中LDH↑

4.慢性肾小球肾炎、SLE、糖尿病肾病等病人中,尿LDH可达正常人3-6倍,尿中含多种抑制LDH活性物质,如尿素

小分子类。

低PH值也可抑制LDH活性。

5.尿毒症患者LDH正常,透析后LDH↑,因为体内尿素较高

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