心肌酶谱
对心肌酶检查,检查心肌酶主要是确定心肌缺血坏死或细胞膜通透性。
1.血清酶总论:P232
LDH、AST、CK及其同I酶,α-HBD
一、血清酶的来源和分类:
(一)根据来源及血浆中发挥作用:
1.血浆持异酶:主要在血浆中发挥催化作用的酶类
eg:凝血酶原,凝血因子(X、ⅫI、Ⅶ)纤溶酶原,前激肽释放酶
铜蓝蛋白:是一种氧化酶,与Fe蛋白,动员有关
脂蛋白脂肪酶:参与脂蛋白中脂肪的水解和储存
2.外分泌酶
eg:唾液和胰淀粉酶,胰脂肪酶,胃蛋白酶,胰蛋白酶和前列腺酸性磷酸酶等。
在血浆中很少发挥催化作用
其浓度与其分泌腺体的功能有关
在血液中无重要的催化作用
(1)一般代谢酶:无器官特异性
(2)组织专一性酶:OCT、SDH、ADH主要存在于肝。其活性能较特异地反映肝cell的病变。
(二)根据酶促反应性质可将酶分为六类:
CHO CHO
C=0+NADH+H+ LDH CH-OH+NAD+
COOH COOH
2.转移酶类:催化底物之间进行某些基团的转移或交换的酶类
COOH CH3 COOH CH3
(CH2)2 +HC-NH2 ALT (CH2)2 + C=0
C=0 COOH HC-NH2 COOH
COOH COOH
3.水解酶:催化底物之间发生水解反应的酶类
ALP
水解
4.裂解酶类:催化底物移去一个基因而留下双键的反应或逆反应的酶类。
磷酸已糖激酶
6.合成酶类(连接酶类):催化两分子底物合成-分子的化合物,同时必须偶联有ATP磷酸键断裂。
二、血清酶的命名:
1.习惯命名法:根据酶来源,催化反应性质及底物来命名。
底物:淀粉酶,蛋白酶
性质:脱氢酶、转移酶
来源:胰淀粉酶、胃蛋白酶
底物+性质:谷草转氨酶
2.系统命名法:酶反应底物、性质均要列出,各底物间以“:”隔开
编号:(1)1为氧化还原酶类
2为转移酶类
3为水解酶类
4为裂解酶
(2)反应作用的位置,即可用于哪个基因
1.1 -CH-OH
1.2 -C=0
1.3 -C=CH
1.4 -C=NH
1.5 -CH-NH2
1.6 NADH、NADPH
(3)
1.1.1 氯化还原酶 CH-OH 受体:NAD+ NADP-
1.1.2 氯化还原酶 CH-OH 受体:细胞色素
1.1.3 氯化还原酶 CH-OH 受体:分子氧
三、血清酶的去路:
(一)血清酶的排泄:P234
2.胆汁不是血清酶排泄途径
(二)肝或网状内皮系统对血清酶的清除:
(四)转入其它体液
四、酶的活性单位及生理差异:
(一)酶的活性单位:在规定条件,每分钟催化1umol的基质发生转化所需要的酶量。
规定条件包括:温度、PH、缓冲系统、基质浓度及辅助因素
(二)酶的单位计算
1.根据标准计算:
(U/L)酶活力单位=A样品/A标准×C标准×Vt/Vs×1/t×1000
总体积-样品+基质
2.根据反应底物的消光系数:
酶活力=A样品/ξd×Vt/Vs×1/t×1000
消光系数 比色杯厚度
(三)血清酶的生理差异:
1.性别:男>女
2.年龄:儿童 磷酸酶>成人 婴儿 LDH 2倍成人
3.进食:对酶活力本身无影响,但可影响比色时的浊度
4.活动:
5.妊娠:ALT、LDH、ALP↑
五、疾病时血清酶改变的机制:
(一)合成异常:P238
1.合成减少
2.合成增加
(二)酶从损伤细胞中释放增加:
是疾病时大多数血清酶↑的主要机制
(三)其它机制:
药物,毒物可作为酶的抑制剂
2.AST的测定:
AST 谷草转氨酶(GOT)
天门冬氨酸氨基移换酶
一、AST分布:
广泛分布于人体各组织、器官中,主要在心、肝、骨骼肌、肾、胰、脾、肺、RBC中。其中以心肌cell含量最丰富。
主要存在线粒体中(M-AST)。胞浆中(C-AST)仅占12%,是可溶性的正常血清中AST很少,只有上述组织发生病变
时,才释放入血。
方法学介绍
(一)赖氏比色法:<实验>P115
1.原理:
COOH COOH COOH COOH
(CH2)2 + CH2 AST (CH2)2 + CH2
C=O HC-NH2 37℃ HC-NH2 C=0
COOH COOH COOH COOH
酮戊二酸 天门冬氨酸 谷氨酸 草酰乙酸
COOH CH3
C=0 脱羧 COOH
COOH
丙酮酸
CH3
C=0 + →丙酮酸-2.4- = +H2O
COOH 硝基苯腙
2.4-二硝基苯肼 酸性,草黄色,加碱,棕红色
与标准浓度丙酮酸生成的苯腙比色(505nm)
2.正常参考值:8-28u
3.注意事项
(1)溶血标本不能用于AST测定,因为RBC中AST是血清10倍。
(2)M-AST、C-AST理化性质,Ag性均不同,由不同基因控制,但催化相同反应,是同I酶
(3)赖氏比色法简易性,相对准确性,所以是普及的原因
(4)难以确定在酶反应期内,产物的生成与时间成正比。
草酰乙酸是AST竞争抑制剂,随反应进程,产物,酶反应不断。
(5)显色反应及底物浓度问题。
酮戊二酸也可与2.4-二硝基苯肼反应,产生另一棕色苯腙,使AST测定假阳性增高。
为了减少其干扰,波长选在490-530nm,此时丙酮酸为-酮戊二酸2倍
2.4-二硝基苯肼在碱性溶液中也可呈色,使吸光度伪性增高。
(6)A、偶联转氨作用:
ALT
丙酮酸+谷氨酸丙氨酸
所以肝疾病AST、ALT同时,使丙酮酸消耗,AST测定结果减低。
B、产物旁路
乳酸
LDH ↑NADH+H+
丙酮酸
↑
α-酮戊二酸+天门冬aa AST 草酰乙酸+谷aa.
↓MDH+NADH+H+
苹果酸
所以受LDH、MDH干扰,使AST测定结果减低
(二)酶偶联一些外连续监测法:
1.原理:L-天门冬aa.+α-酮戊二酸 AST 草酰乙酸+谷aa.
草酰乙酸+NADH+H+ MDH L-苹果酸+NAD+
340nm
吸光度下降值,计算AST活力
2.参考值:男<40u/L 37℃
女<35u/L 37℃
3.注意事项:
(1)采血后立即分离血清,避血溶血
血清与血块不可长时间设置在一起
(2)血清,室温4-8h,2-6℃ 7d -20℃ 8月 活力不变
(3)抗凝剂血浆:
EDTA、2Na,肝素对AST无抑制作用
不能用草酸盐抗凝剂,因为可抑制AST活性
(4)AST浓度过高,稀释重做。
(5)不存在偶联转氨作用和产物旁路问题
(6)不存在 酮戊二酸干扰,可适当提高底物浓度使反应完全
(7)底物中存在谷氨酸脱氢酶(GLDH)
α-酮戊二酸+NADH+H++NH3 GLDH 谷aa.+NAD++H2O
消耗NADH+H+,使结果伪性增高。
(8)轿清中丙酮酸LDH
丙酮酸+NADH+H+ LDH 乳酸+HAD+
消耗NDAH+H+,使结果偏高
(9)在指示酶作用有,草酰乙酸可自动脱羧生成丙酮酸,使结果偏低。应加LDH,使之成为乳酸,从而更加准
确反映AST活力。
所以MDH、LDH共同作为指示酶
三、临床意义:
1.AST在心肌中含量最多,所以在急性心梗时6-12h↑,48h达高峰,3-5d恢复正常
3.急性肝炎,AST,ALT同时↑,可达正常值10-30倍,黄疸前期就已↑,有助于临床早期诊断。
3.AST同I 酶:
<黄>血清酶测定时诊断心梗的意义:
心肌C、肝C出现实质性损害 M-AST C-AST↑
M-AST↑对肝病预后有一定诊断意义
心梗M-AST↑ 所以M-AST越↑,心梗并发心衰的发病率、死亡率越↑,尤其推测死亡率方面意义更大。
4.血清乳酸脱氢酶的测定: 原理 PH对其影响
LDH 糖酵解酶,氧化还原反应
有五种同I酶LDH1-LDH5
一、LDH分布和特点:
广泛分布,主要在肾,其次心,骨骼肌,其它肝、脾、胰、肺,上述组织病变,血清中LDH。主要催化以下反应:
L-乳酸+NAD+ 丙酮酸+NADH+H+
PH碱 正反应(L-P)
PH中性 逆反应(P-L)
二、方法学
(一)比色法:<实验>P122
1.原理:L-乳酸+NAD+ LDH 丙酮酸+NADH+H+
PH8.8
丙酮酸+2.4-二硝基苯肼 → 丙酮酸-2.4-二硝基苯腙
酸 草黄色
加NaOH 棕红色
颜色越深,酶活力越大
2.参考值:225-540u/dL
3.注意事项:产物生成量与反应时间不成比例
(1)标本严禁溶血 因为RBC内LDH活力是血清内的100倍。
(2)LDH受重金属盐、EDTA、草酸盐的抑制。最好用血清标本
(3)血清标本2-6 数天,室温48h
(4)准确性和重复性在酶学检验中最差,因为五种同I酶与底物结合能力不同,最适反应条件不同,在病理
LDH组成差异大,所以很难找出LDH最适反应条件。eg:心梗LDH1↑,肝病LDH5↑
(5)结果>2500u/dL,将标本稀释重做。
(二)连续监测法(酶法):<实验>P120
1.原理:L-乳酸+NAD+ PH8.8-9.8 丙酮酸+NADH+H+
逆反应比正反应速度快2-3倍 所以反应偏向左侧,多用P-L
LDH
丙酸酸+NADH+H+乳酸+NAD+
PH7.4
340nm处监测,吸光度下降幅度与LDH成正比。
2.参考值:240-460u/L 37℃
3.注意事项:
(1)逆反应优点:
a.试剂用量少,所需NAD+,只是L-P所用NADH+H+的3%,样品少
b.单位时间内吸光度变化大,逆反应线性范围较大,酶促反应速率比正反应快3倍,利于测定。 时间短
c.酶活力随时间的线性关系较长
(2)正反应优点:
a.NADH+H+比NAD+稳定,价格低,易得到纯品。
底物L-乳酸与逆反应底物丙酮酸稳定
b.L-乳酸对LDH的抑制低于丙酮酸对LDH的抑制
(3)连续监测法可利用正、逆反应,优于比色法。
(4)金属离子的存在可以降低NAD+稳定性
试剂中可加入EDTA,使EDTA络合金属离子,增加NAD+稳定。
(5)NAD+不稳定,产生对LDH有抑制作用的物质。在碱性液中比在酸性液中稳定,在Tris缓冲液中比在磷酸
盐缓冲液中稳定。
(6)某些批号的NADH+H+还有LDH的物质,使用前检查NADH+H+质量,NADH+H+溶于Tris缓冲液,分别在
260nm和340nm测吸光度,应<2.3,若>2.3,说明含有在260nm处有吸收峰的杂质,如NAD+、腺苷。
(8)标本不能溶血
三、临床意义:
1.LDH↑:急性心梗、骨骼肌损伤、某些肝炎、白血病、肝硬化、阻塞性黄疸及恶性肿瘤。
2.心梗:12-24h,LDH↑,48-72h达高峰,1-2W后恢复正常
3.恶性肿瘤晚期LDH,恶性肿瘤引起的胸腹水中LDH↑
4.慢性肾小球肾炎、SLE、糖尿病肾病等病人中,尿LDH可达正常人3-6倍,尿中含多种抑制LDH活性物质,如尿素,
小分子肽类。
低PH值也可抑制LDH活性。